標(biāo)準(zhǔn) DB37T 3573-2019 牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程規(guī)范

1、ICS FORMTEXT 11.220 FORMTEXT B 41 FORMTEXT DB FORMTEXT 37DB FORMTEXT 37/T FORMTEXT 35732019 FORMTEXT FORMTEXT 牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程 FORMTEXT Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma Bovis2019 - 05 - 29發(fā)布2019 - 06 - 29實(shí)施 FORMTEXT 山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB37/T 35732019 HYPERLINK l _Toc860868 前言 PAGEREF _Toc860868 h

2、 II HYPERLINK l _Toc860869 1 范圍 PAGEREF _Toc860869 h 1 HYPERLINK l _Toc860870 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc860870 h 1 HYPERLINK l _Toc860871 3 術(shù)語與定義 PAGEREF _Toc860871 h 1 HYPERLINK l _Toc860875 4 試劑及儀器 PAGEREF _Toc860875 h 1 HYPERLINK l _Toc860876 4.1 試劑 PAGEREF _Toc860876 h 1 HYPERLINK l _Toc860877 4.2 儀

3、器 PAGEREF _Toc860877 h 2 HYPERLINK l _Toc860878 5 樣品采集與處理 PAGEREF _Toc860878 h 2 HYPERLINK l _Toc860879 5.1 疑似牛支原體感牛只的判斷 PAGEREF _Toc860879 h 2 HYPERLINK l _Toc860880 5.2 疑似病例樣品的采集 PAGEREF _Toc860880 h 2 HYPERLINK l _Toc860881 5.3 樣品處理 PAGEREF _Toc860881 h 2 HYPERLINK l _Toc860882 6 微生物學(xué)檢測法 PAGEREF

4、_Toc860882 h 2 HYPERLINK l _Toc860883 6.1 液體培養(yǎng) PAGEREF _Toc860883 h 2 HYPERLINK l _Toc860884 6.2 菌落形態(tài)觀察 PAGEREF _Toc860884 h 2 HYPERLINK l _Toc860885 6.3 Dienes染色 PAGEREF _Toc860885 h 3 HYPERLINK l _Toc860886 6.4 生化試驗(yàn) PAGEREF _Toc860886 h 3 HYPERLINK l _Toc860887 6.5 結(jié)果判定 PAGEREF _Toc860887 h 3 HYPE

5、RLINK l _Toc860888 7 核酸檢測法 PAGEREF _Toc860888 h 3 HYPERLINK l _Toc860889 7.1 DNA模板的制備 PAGEREF _Toc860889 h 3 HYPERLINK l _Toc860890 7.2 PCR檢測 PAGEREF _Toc860890 h 3 HYPERLINK l _Toc860891 7.3 凝膠電泳 PAGEREF _Toc860891 h 4 HYPERLINK l _Toc860892 7.4 質(zhì)量控制 PAGEREF _Toc860892 h 4 HYPERLINK l _Toc860893 7.

6、5 結(jié)果判定 PAGEREF _Toc860893 h 4 HYPERLINK l _Toc860894 8 廢棄物的處理和檢測過程中安全措施 PAGEREF _Toc860894 h 4 HYPERLINK l _Toc860895 9 操作注意事項(xiàng) PAGEREF _Toc860895 h 5 HYPERLINK l _Toc860896 附錄A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基的制備方法 PAGEREF _Toc860896 h 6前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科

7、學(xué)院奶牛研究中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、威海市畜牧獸醫(yī)局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張亮、楊宏軍、解曉莉、孫陽陽、儲岳峰、趙國清、程凱慧、楚會(huì)萌、劉來興、楊美。牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛支原體診斷技術(shù)的術(shù)語和定義、試劑及儀器、樣品的采集與處理方法、生化鑒定方法、核酸檢測方法和操作注意事項(xiàng)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 66822008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 14926.82001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8、支原體檢測方法GB 159811995消毒與滅菌效果的評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)GB 194892008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。牛支原體Mycoplasma bovis柔膜菌綱支原體目支原體科支原體屬，可引起成母牛乳腺炎、犢牛肺炎和關(guān)節(jié)炎等多種疾病的病原之一。Dienes染色液一種經(jīng)典的利用天青美藍(lán)染色檢測支原體的染色液。類胸膜肺炎微生物培養(yǎng)基Pleuropneumonia-Like Organisms medium，PPLO培養(yǎng)基該培養(yǎng)基主要成分為牛心湯、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚紅、葡萄糖等成分，主要用于多種支原體的分離和培養(yǎng)。試劑及儀器試劑去離子水（符合

9、GB 66822008的相應(yīng)要求）；牛支原體檢測培養(yǎng)基所需試劑及配制方法見附錄A；Taq DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液；生理鹽水；Dienes染色液；TAE電泳緩沖液；瓊脂糖儀器接種環(huán)、酒精燈、移液器（5100 L和1001 000 L）、槍頭（200 L和1 mL）、培養(yǎng)試管（15 mL）和玻璃平皿（90 mm）、CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器、1 L容量瓶、核酸擴(kuò)增儀、電泳儀、高壓滅菌鍋、正置光學(xué)顯微鏡。樣品采集與處理疑似牛支原體感牛只的判斷肺炎型，主要表現(xiàn)為咳嗽、喘，有清亮或膿性鼻液，伴隨出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎或角膜結(jié)膜炎；不同病死牛只的病變差異較大，通常病牛心葉及部分膈葉的局部紅色肉變，或同時(shí)有化膿灶散在

10、分布。乳腺炎型，主要表現(xiàn)為臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎，前者乳汁帶血或呈灰色，后者體細(xì)胞數(shù)較高，無明顯臨床癥狀，但多數(shù)情況下單純感染無明顯的紅腫熱痛。關(guān)節(jié)炎型，主要表現(xiàn)為犢牛膝關(guān)節(jié)腫大、跛行，關(guān)節(jié)炎淡黃色或濃稠，常與肺炎性伴隨發(fā)生。疑似病例樣品的采集根據(jù)“5.1”所述牛支原體感染的三種臨床表現(xiàn)型，分別進(jìn)行樣品的采集，具體要求如下：肺炎型：應(yīng)采集新病死牛只的肺部實(shí)變部分或病牛的鼻腔液，置專用采樣器或無菌容器中；乳腺炎型：采集前，應(yīng)棄病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁約15 mL，置注射器或無菌容器中；關(guān)節(jié)炎型：對采集部位進(jìn)行消毒后穿刺吸取關(guān)節(jié)液約2 mL5 mL，置注射器或無菌容器中。樣品處理組織樣品的

11、處理剪至云霧狀后，用2 mL生理鹽水重懸，7 500g離心5 min，用注射器吸取1 mL上清液經(jīng)0.45 m濾膜濾過后備用。鼻拭子的處理用2 mL生理鹽水浸潤拭子后，7 500 g離心5 min，吸取1 mL上清液經(jīng)0.45 m濾膜濾過后備用。奶樣或關(guān)節(jié)液樣品的處理分別取1 mL原液與1 mL生理鹽水充分混合，7 500 g離心5 min，用注射器吸取1 mL上清液經(jīng)0.45 m濾膜濾過后備用。微生物學(xué)檢測法液體培養(yǎng)將0.5 mL“5.3”所述處理所得上清液加入到含4.5 mL PPLO液體培養(yǎng)基的試管中，置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，選擇PPLO液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色且透亮

12、的培養(yǎng)液用于進(jìn)一步檢驗(yàn)。菌落形態(tài)觀察取50 L疑似液體培養(yǎng)陽性的樣品加入到PPLO固體培養(yǎng)基（配方見附錄A）上，涂布均勻后，置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天后，4倍物鏡下觀察菌落形態(tài)。Dienes染色將有可疑菌落的固體培養(yǎng)基平皿進(jìn)行Dienes染色，37 孵育30 min后，觀察菌落顏色。生化試驗(yàn)洋地黃皂苷敏感試驗(yàn)將“6.1”中變?yōu)辄S色的培養(yǎng)液，1:10接種于含0.2 mg/mL洋地黃皂苷的PPLO液體培養(yǎng)中，置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀察培養(yǎng)基顏色變化。當(dāng)培養(yǎng)基顏色不變時(shí)，說明洋地黃皂苷敏感；當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，說明洋地黃皂苷不敏感。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)

13、培養(yǎng)基配制方法見“附錄A”。將“6.1”中變?yōu)辄S色的培養(yǎng)液，1:10接種于葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀察培養(yǎng)基顏色變化。當(dāng)培養(yǎng)基顏色不變時(shí)，說明不發(fā)酵葡萄糖；當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，說明發(fā)酵葡萄糖。精氨酸水解試驗(yàn)精氨酸水解試驗(yàn)培養(yǎng)基配制方法見“附錄A”。將“6.1”中變?yōu)辄S色的培養(yǎng)液，1:10接種于精氨酸水解試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀察培養(yǎng)基顏色變化。當(dāng)培養(yǎng)基顏色不變或變黃時(shí)，說明不水解精氨酸；當(dāng)培養(yǎng)基顏色變紅時(shí)，說明水解精氨酸。結(jié)果判定當(dāng)同時(shí)滿足以下條件時(shí)，判定為牛支原體陽性：鏡檢存在圓形、中間有顆粒或隆起的煎蛋樣菌落；

14、Dienes染色菌落為藍(lán)色；生化鑒定結(jié)果為洋地黃敏感、不能發(fā)酵葡萄糖、不能水解精氨酸。其他情況均視為牛支原體陰性。核酸檢測法DNA模板的制備水煮法取“5.3”所述的上清樣1 mL于滅菌的2 mL Eppendorf管中，12 000g離心12 min，棄上清，沉淀重懸于200 L無菌ddH20中，沸水浴15 min后立即冰浴2 min，待Eppendorf管冷卻后12 000g離心10 min，取上清液即為樣品DNA模板。試劑盒法提取樣品DNA模板時(shí)，采用商品化的支原體基因組DNA提取試劑盒或革蘭氏陰性菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟參照商品化試劑盒說明書。PCR檢測PCR反應(yīng)引物參

15、照國際上常用的PCR診斷方法，選擇針對牛支原體設(shè)計(jì)的一對特異性引物用于PCR檢測（Subramaniam, et al. Molecular & Cellular Probes, 1998.），目標(biāo)產(chǎn)物大小為1 626 bp，引物信息如下：MBOUVRC2-L：5- TTACGCAAGAGAATGCTTCA -3MBOUVRC2-R：5- TAGGAAAGCACCCTATTGAT -3PCR反應(yīng)體系經(jīng)“7.1”提取的樣品DNA模板，以牛支原體DNA作為陽性對照，ddH2O為陰性對照。PCR反應(yīng)體系如表1。牛支原體PCR反應(yīng)體系中各成分添加量試劑名稱用量Taq 酶（1 000 U/mL）1 L1

16、0反應(yīng)緩沖液（含鎂離子）2 LdNTP（10 mM）1 L上游引物（10 M）1 L下游引物（10 M）1 L檢測模板5 LddH209 L總體積20 LPCR反應(yīng)條件95 預(yù)變性5 min；循環(huán)設(shè)置為95 變性30 s，52 退火30 s，72 延伸1.5 min，設(shè)置36個(gè)循環(huán)；72 充分延伸10 min；降溫至4 后取出產(chǎn)物待檢。凝膠電泳采用1.5 %瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下，電泳35 min后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察樣品孔是否存在大約1 600 bp左右的亮帶。質(zhì)量控制若陽性對照存在1 600 bp左右的亮帶，且陰性對照無此亮帶，即陰陽性對照成立，可進(jìn)行結(jié)果判定；反之，則應(yīng)重復(fù)PC

17、R檢測試驗(yàn)。結(jié)果判定電泳結(jié)果存在1 600 bp左右亮帶，所對應(yīng)樣品被判定為牛支原體陽性；其他情況均可被判定為牛支原體陰性。廢棄物的處理和檢測過程中安全措施 按照GB 194892008中規(guī)定執(zhí)行。操作注意事項(xiàng)牛支原體的分離培養(yǎng)與檢測應(yīng)在獨(dú)立試驗(yàn)空間進(jìn)行，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，以避免交叉污染。采集樣本應(yīng)避免冷凍或高溫，冷藏條件下48 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。支原體培養(yǎng)基的配置應(yīng)選用去離子水。從高度疑似樣品中分離培養(yǎng)支原體時(shí)，如液體培養(yǎng)無變色，應(yīng)繼續(xù)盲傳23代。培養(yǎng)、PCR和染色檢測，均應(yīng)設(shè)置陰性對照和陽性對照。（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基的制備方法PPLO液體培養(yǎng)基（pH值為7.6）PPLO粉21.0 g，

18、酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸鈉2.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚紅溶液4 mL，116 滅菌20 min（按照GB 159811995執(zhí)行），加入56 滅活的馬血清150 mL和20萬單位青霉素，調(diào)節(jié)pH值為7.6，每4.5 mL分裝至15 mL培養(yǎng)管，冷藏保存1個(gè)月。PPLO固體培養(yǎng)基（pH值為7.6）PPLO粉21.0 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸鈉2.0 g，瓊脂粉20.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚紅溶液4 mL，116 滅菌20 min（按照GB 159811995執(zhí)行），冷卻至55 左右。無菌操作加入56 滅活的馬血清150 mL和20萬單位青霉素，調(diào)節(jié)pH值為7.6，每15 mL倒入90 mm無菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固，室溫保存1周，冷藏保存1個(gè)月。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基PPLO粉2.1 g，酵母粉0.25 g，葡萄糖0.25 g，溶于85 mL ddH2O中，加