感染性病原真菌檢驗技術(shù)

1、感染性病原真菌檢驗技術(shù)1、組織胞漿菌屬本屬為典型的雙相型真菌，37呈酵母樣細胞，25培養(yǎng)形成菌絲體。重要的致病菌有莢膜組織胞漿菌及假皮疽組織胞漿菌，分別致犬、貓肉芽腫及馬的淋巴管炎。莢膜組織胞漿菌引起人獸共患病是致犬、貓和人常發(fā)的高度接觸性傳染性組織胞漿菌病。嚴重者，可損傷全身器官。 淋巴瘤、白血病、霍奇金病、AIDS或用腎上腺皮質(zhì)激素治療者?？筛腥颈揪Ｖ饕址妇W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，寄生在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)，使感染組織形成肉芽腫。奶牛、馬、羊、豬及嚙齒類動物也可自然感染，小鼠易感染。微生物特性在巨噬細胞和網(wǎng)狀細胞內(nèi)寄生時呈細小的、包有莢膜的圓球樣細胞，直徑l3m。在陳舊的病灶內(nèi)，菌體較大，胞漿濃縮

2、于菌體中央，與細胞壁之間出現(xiàn)一條空白帶。 2225培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基上緩慢形成絲狀菌落，開始為白色，逐漸變?yōu)樽攸S色。菌絲分支分隔，寬2.5m。產(chǎn)生橢圓形光滑或多刺小分生孢子，直徑2.53m，隨后可產(chǎn)生圓形或橢圓形大分生孢子，稱棘狀厚壁大孢子，直徑815m，表面光滑、均勻間隔的，像手指一樣凸起，是本菌的特征性形態(tài).在高濕、高濃度的二氧化碳中37培養(yǎng)時，在營養(yǎng)豐富的血培養(yǎng)基上，可形成濕潤、有光澤、表面有皺褶的細小酵母樣菌落；在肉湯中呈絮團狀生長，鏡檢可見分支分隔的菌絲和少量孢子。鏡檢如發(fā)現(xiàn)特征性的棘厚壁大孢子，可做出診斷?；铙w病變組織末梢血及骨髓觸片或涂片瑞氏染色，在單核細胞或多形核細胞中如有小的、

3、呈洋蔥切面樣卵圓形孢子，亦可做出診斷。病料接種小鼠可引起發(fā)病死亡，并可檢出本菌。補體結(jié)合反應(yīng)一般在發(fā)病后23周呈陽性反應(yīng)。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗可用于犬感染的流行病學(xué)調(diào)查。亦可采用PCR和核酸探針技術(shù)鑒定,微生物檢驗(1)標本直接顯微鏡檢查痰液標本涂片后先用甲醇固定10 min，再用姬姆薩染色鏡檢，如巨噬細胞發(fā)現(xiàn)卵圓形孢子，直徑24m的較小，一端有出芽，可疑為莢膜組織胞漿菌。(2)抗原檢測取患者痰液作免疫熒光法染色后鏡檢，可快速檢測其抗原，但特異性差，僅作組織胞漿菌初篩試驗。(3)分離培養(yǎng)兩相型將臨床標本接種于含抗生素的沙氏培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)，生長緩慢，46周才開始生長，逐漸形成白色至棕色絨毛狀菌落

4、。當轉(zhuǎn)種于血瓊脂培養(yǎng)基上，37 很快形成酵母型菌落。(4)鑒定生化反應(yīng)取可疑菌落涂片染色鏡檢，并作脲酶試驗和明膠液化試驗。莢膜組織胞漿菌分解尿素；不能液化明膠。(5)藥物敏感試驗 組織胞漿菌對兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑敏感。(6)抗體檢測檢測血清中組織胞漿菌抗體，以補體結(jié)合試驗的敏感性和特異性最高，發(fā)病2-3周陽性率可達90，有判定價值。補體結(jié)合試驗的抗體效價在：32以上為陽性，抗體效價4倍增長，可有助于確診。乳膠凝集試驗時，抗體效價為1：32時可確診。 假皮疽組織胞漿菌馬屬動物流行性淋巴管炎的病原，特征為皮下淋巴管和淋巴結(jié)發(fā)炎、腫脹和皮膚潰瘍。在自然情況下，馬、騾最易感，驢次之；人、犬、駱

5、駝、牛、豬很少感染；家兔、豚鼠人工感染可引起局部膿腫。微生物特性在膿汁中該菌呈卵圓形或瓜子形，是具有雙層膜的酵母樣細胞。大小為23m35m，一端或兩端較尖，多單在或23個排列，菌體胞漿均勻，可見24個圓形、呈回旋運動的小顆粒。在培養(yǎng)物中呈菌絲狀，分支分隔、粗細不勻，菌絲末端形成瓶狀假分生孢子。本菌為需氧菌，最適生長溫度2530，最適生長pH59，常用培養(yǎng)基有1%葡萄糖甘露醇甘油瓊脂、2%葡萄糖甘油瓊脂等。不發(fā)酵多種糖類，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和H2S，VP試驗陰性，能凝固石蕊牛乳，液化明膠。取膿汁或分泌物，適當稀釋、鏡檢，或取痂皮，加10%KOH處理透明后，制片鏡檢。必要時可進行分離培養(yǎng)，病料應(yīng)先用青、

6、鏈霉素處理12h后再接種。長出典型菌落時，用生理鹽水制成懸液，接種家兔或豚鼠，觀察有否膿腫，作為診斷參考。可根據(jù)是否產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)做出診斷。方法是用該菌的培養(yǎng)物頸部皮內(nèi)注射，4872h后測定皮膚增厚及腫脹性質(zhì)，如注射局部發(fā)生硬固的熱痛腫脹，皮膚增厚超過5mm即為陽性。此法特異性強，檢出率高達80%以上。應(yīng)用經(jīng)高壓后酒精或乙醚提取的抗原進行沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)檢查馬血清中的抗體，也是有效的診斷方法。2、念珠菌屬該菌屬半知菌綱的酵母菌念珠菌屬有150多個種，僅白色念珠菌是常見的病原，致人和動物的念珠菌病。白色念珠菌存在于人和動物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜，是機會致病菌，患念珠菌病的動物多在消

7、化道黏膜形成乳白色偽膜斑壞死物，主要侵害家禽，特別是雛雞。牛、豬、犬和嚙齒動物也可能感染。白色念珠菌致病性條件致病皮膚粘膜感染 鵝口瘡，陰道炎內(nèi)臟感染：肺炎、關(guān)節(jié)炎、膀胱炎，腎盂腎炎中樞神經(jīng)感染：腦膜（腦）炎、腦膿腫過敏微生物特性假絲酵母菌呈圓形或卵圓形，直徑3-6m。革蘭陽性，著色不均勻。出芽方式繁殖。在組織內(nèi)可見芽生孢子、假菌絲；在玉米粉培養(yǎng)基中可產(chǎn)生假菌絲和厚膜孢子。微生物檢驗(1)直接顯微鏡檢查：取膿汁、痰和局部炎癥性分泌物直接涂片，革蘭染色后鏡檢，顯微鏡見到革蘭陽性(著色不均勻)、圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，可確認為假絲酵母菌感染。(2)抗原檢測：取病人血清作ELISA、免疫印跡

8、法等檢測白色念珠菌抗原。(3)核酸檢測：用PCR法將白色念珠菌DNA分子擴增后以分子探針檢測，具有較好的敏感性和特異性。 (4)分離培養(yǎng) 將標本接種在沙氏培養(yǎng)基上，25或37培養(yǎng)1d后，可出現(xiàn)奶油色類酵母型菌落。鏡檢可見假菌絲和芽生孢子。(5)鑒定:1)芽管形成試驗：將假絲酵母菌接種于0.20.5m|血清中，37孵育1.5h觀察有無芽管形成。白色念珠菌可形成芽管，其他假絲酵母菌不形成芽管。2)厚膜孢子形成試驗：將假絲酵母菌接種于玉米粉培養(yǎng)基25孵育1-2d后，白色念珠菌在菌絲頂端、側(cè)緣或中間形成厚膜孢子。 3)糖同化或發(fā)酵試驗凡發(fā)酵某種糖一定能同化該糖，故只需做那些不發(fā)酵糖的同化試驗。將假絲酵

9、母菌接種糖發(fā)酵管，25孵育，一般觀察23d，對不發(fā)酵或弱發(fā)酵管可延長至10d或2-4周。觀察有無酵母生長或液體培養(yǎng)基是否變混濁?，F(xiàn)在商品化的產(chǎn)色培養(yǎng)基可快速鑒定白色念珠菌和其他假絲酵母菌。(6)藥物敏感試驗：對二性霉素B、5-FC等藥物敏感，但對5-FC極易產(chǎn)生耐藥性。(7)抗體檢測：早期診斷可用ELlSA夾心法、免疫酶斑點試驗，方法簡便。也可用乳膠凝集試驗和對流免疫電泳試驗等檢測血清中抗白色念珠菌抗體。(8)動物試驗：將假絲酵母菌懸液注射1ml于家兔耳靜脈或注射0.2ml于小白鼠尾靜脈，假絲酵母菌對動物無致病性。3、隱球菌屬包括17個種和7個變種，廣泛分布于自然界，人體體表、口腔和腸道中。外

10、源性感染, 經(jīng)呼吸道侵入，由肺經(jīng)血行播散,可侵犯肺、腦及腦膜、皮膚、骨和關(guān)節(jié)。好發(fā)于細胞免疫功能低下者，如AIDS、惡性腫瘤、糖尿病、器官移植及大劑量使用糖皮質(zhì)激素者?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)新生隱球菌、淺白隱球菌和羅倫隱球菌有致病性。新型隱球菌引起的人獸共患病新型隱球菌在自然界廣泛存在，可從土壤、空氣、水果、牛乳，以及人的皮膚、腸道中分離到。易感新型隱球酵母病的動物有犬、貓，豬、馬、牛和禽類，特別是鴿子，可作為其自然寄主和主要傳染體。其主要傳染途徑是：孢子隨塵埃被人吸入后停留于肺部，繼而血行播散；通過體表外傷侵入人體；食用被污染，特別是被鴿糞污染的食品，發(fā)生腸道感染，繼而血行播散。進入人體的病菌可到達很多部

11、位并發(fā)病，其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為最常見，如腦膜炎，其次有肺炎、腎炎、敗血癥以及皮膚、骨骼等癥狀。 微生物特性在組織中呈圓形或卵圓形，直徑一般在46m，外周有寬厚莢膜，莢膜較菌大13倍，折光性強，一般染色法不易著色而難以發(fā)現(xiàn)而得名。常采用墨汁負染色法，在黑色景下可鏡檢到透亮菌體和寬厚莢膜。非致病性隱球菌無莢膜。微生物檢驗(1) 標本直接鏡檢：用病人腦脊液作墨汁負染色檢查是診斷隱球菌腦膜炎最簡便、快速方法。常規(guī)細胞染色可發(fā)現(xiàn)隱球菌，但易誤診和漏診。如用PAS染色后新生隱球菌呈紅色。(2) 抗原檢測用乳膠凝集試驗、ELISA、和單克隆抗體法等免疫學(xué)方法檢測隱球菌莢膜多糖特異性抗原，已成為臨床上的常

12、規(guī)診斷方法。其中以乳膠凝集試驗最為常用，此法簡便、快速。特別對直接鏡檢和分離鑒定陰性者更有診斷價值。ELISA敏感性和特異性都較高。單克隆抗體法除有較高敏感性和特異性外，標本無須稀釋和預(yù)先處理的優(yōu)點。(3) 核酸檢測可用痰液、支氣管吸出物等標本核酸檢測方法有DNA探針法、PCR探針法等，用于檢測的探針、引物主要選自保守區(qū)的重復(fù)序列。可檢出新生隱球菌，并可區(qū)別類型，是新生變種還是格特變種。非致病性隱球菌不被檢出。此方法不受藥物治療的影響，還能正確評價臨床療效和愈后等。 (4) 分離培養(yǎng)將標本接種在沙氏培養(yǎng)基上，病原性隱球菌在25和37生長，而非病原性隱球菌在37時不生長。培養(yǎng)25d后觀察菌落形態(tài)

13、特點，并取菌落作印度墨汁負染色鏡檢。() 鑒定1）酚氧化酶試驗：接種L-多巴枸櫞酸鐵和咖啡酸培養(yǎng)基中，經(jīng)25d培養(yǎng)，呈棕黑色菌落。2）脲酶試驗：能產(chǎn)生脲酶分解尿素瓊脂培養(yǎng) 基中的尿素形成NH4+和CO2，使pH升高，培養(yǎng)基可由黃色變粉紅色，而白假絲酵 母菌為陰性。3）糖同化及發(fā)酵試驗：能同化葡萄糖、 半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能發(fā)酵多糖 類，不能同化硝酸鹽。非致病性隱球菌不能同化肌醇。絲囊霉菌微生物特性外形與真正的真菌相似，由纖細的分支的絲狀菌絲組成。但細胞壁由纖維素構(gòu)成，而大多數(shù)真菌的細胞壁成分是幾丁質(zhì)。絲囊霉菌還有管狀的線粒體嵴，也有別于真正的真菌。菌絲的一系列片段均可發(fā)育成孢子囊。孢子囊的

14、形成和發(fā)射孢子的適宜溫度為1624，但完成從初級孢子到次級游走孢子形成過程的適宜溫度是24。次級游走孢子運動綴慢而不協(xié)調(diào)。不同基因型的螯蝦絲囊霉菌在生活過程中均會產(chǎn)生高水平的幾丁酶，有一定鑒別意義。微生物檢驗通過病原分離和形態(tài)學(xué)鑒別迸行診斷。無菌切取感染組織12mm2的小片置分離培養(yǎng)基表面，室溫下培養(yǎng)，將出現(xiàn)的菌絲轉(zhuǎn)移到新鮮的瓊脂平板上，直到平板無其他污染菌為止。鑒定絲囊霉菌屬必需誘導(dǎo)并觀察孢子形成。取帶有生長活力菌絲的一小塊瓊脂（直徑34cm），置于GPY肉湯中20孵育4d，用滅菌的池塘水洗5次，然后于其中20過夜。大約12h后形成原代孢囊群落，在顯微鏡下可見出現(xiàn)能游動的次級游走孢子。再結(jié)合

15、典型的絲囊霉菌無性繁殖特征可鑒定到種。近年來發(fā)展的PCR、原位雜交等技術(shù)可檢測種特異性rRNA基因，簡便快捷，適用于大規(guī)模樣品的檢測。5、肺孢菌屬肺孢菌是一種機會病原微生物，可感染馬、牛、羊、豬、犬、貓、鼠等多種動物，有宿主特異性。在正常健康的宿主體內(nèi)通常不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，而在免疫功能低下的動物體內(nèi)可引起嚴重的肺炎。特征為明顯的呼吸道癥狀，普遍性或局灶性肺炎，肺泡內(nèi)充滿孢子。卡氏肺孢菌為感染動物的肺孢菌曾稱為卡氏肺孢子蟲。分類還存在一些爭議。已往大多數(shù)學(xué)者依據(jù)抗原蟲藥有效和具有孢囊、滋養(yǎng)體兩種形態(tài)，認為應(yīng)屬于原蟲。近來分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，卡氏肺孢子蟲線粒體的16s和5s核糖體RNA的核苷酸

16、序列與真菌有更多的同源性，染色特性也類似真菌，應(yīng)歸屬于真菌?？ㄊ戏捂呔鷱V泛分布于自然界，主要是空氣傳播，在健康人體內(nèi)，多為無癥狀的隱性感染。當宿主免疫力下降，潛伏的卡氏肺孢菌在病人肺內(nèi)大量繁殖擴散，使肺泡上皮細胞受損，導(dǎo)致間質(zhì)性漿細胞肺炎，又稱卡氏肺孢菌性肺炎, 是AIDS最常見、最嚴重的機會感染性疾病，病死率高達70100。微生物特性生活史有包囊和滋養(yǎng)體兩種形態(tài)。滋養(yǎng)體壁較薄，單個核，形態(tài)不規(guī)則，直徑25m，姬氏染色后胞質(zhì)呈藍色，核呈紫紅色。包囊為感染型，滋養(yǎng)體為繁殖型，呈二分裂法繁殖。包囊分為成熟包囊和未成熟包囊，前者壁較厚，直徑68m，呈球形，內(nèi)含8個囊內(nèi)小體，大小11.5m，呈球形排列規(guī)則或不規(guī)則單個核；后者一般呈橢圓形，35