糞便 病原菌的分離與鑒定課件

1、糞便標(biāo)本2病原菌的分離與鑒定1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?糞便標(biāo)本中常含有很多雜菌，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康木牟煌x擇培養(yǎng)基，以利于病原菌的檢出。而且，因其各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌。常見的病原菌有志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。 這次實(shí)驗(yàn)中我們從糞便標(biāo)本中檢出的是大腸埃希菌、痢疾志賀菌。而且，我們從這次的綜合性實(shí)驗(yàn)中了解到了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握了微生物試驗(yàn)的基本技能和基本原理，樹立了牢固的無菌觀念。同時(shí)培養(yǎng)了我們的動(dòng)手能力和表達(dá)能力。2糞便標(biāo)本直接糞便檢查 革蘭染色單染色動(dòng)力觀察及制動(dòng)試驗(yàn)初步結(jié)果報(bào)告需氧培養(yǎng)增菌培養(yǎng)直接分

2、離堿性胨水堿性平板分離菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng)增菌液菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng)SS平板副溶血性弧菌選擇性平板菌落形態(tài)生化反應(yīng)厭氧培養(yǎng)微需氧培養(yǎng)及特殊培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果3 1.實(shí)驗(yàn)材料接種針、接種環(huán)、油性筆、打火機(jī)、試管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21型 生物顯微鏡、1500W電爐、蒸餾水、玻片缸、消毒液、1新潔而滅、天平、砝碼、細(xì)菌干粉培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂）、錐形瓶、量筒、試管筐、糖發(fā)酵微量管（葡萄糖、乳糖）、滅菌平皿、試管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、稱量紙、硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋、尺子、藥勺、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95乙醇、稀釋石炭酸復(fù)

3、紅）、小砂輪、痢疾血清、青霉素、鏈霉素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片、線繩、香柏油、擦油紙4 2.實(shí)驗(yàn)方法2.1培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌培養(yǎng)基制備的一般程序：調(diào)配溶化 矯正pH 分裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定保存。干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好 放入講臺(tái)邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)送到高壓滅菌室（洗刷室）。52.2細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 2.2.1采用平板劃線分離法，將取糞便標(biāo)本中混雜的多種細(xì)菌，在伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基表面劃線，使之分散成單個(gè)細(xì)菌，在37培養(yǎng)24h，從而分離出肉眼可見的單個(gè)菌落。 2.2.2細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

4、特征的觀察。觀察形成菌落的大小、形狀、邊緣、表面、溶血性、色素、透明度、濕潤(rùn)度。2.2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落。挑選這兩種不同菌落分別在斜面培養(yǎng)基上接種，標(biāo)記，在37培養(yǎng)18h。2.2.4細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)量、菌苔形狀、表面形狀、光澤、透明度、顏色等。2.2.5液體培養(yǎng)基接種法。用接種環(huán)在固體或斜面培養(yǎng)基上挑選紫黑色和粉紅色菌苔少許移入液體培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混勻。在35培養(yǎng)46h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況 72.3細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征的觀察2.3.1取兩塊玻片，在每塊

5、玻片上加生理鹽水34ul，2滴，在斜面培養(yǎng)基上取紫黑色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第一塊玻片上的一滴鹽水混勻，再取粉紅色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第二塊玻片上的一滴鹽水混勻，涂成1cm2；做好標(biāo)志。經(jīng)在空氣中干燥后，再用酒精燈對(duì)其進(jìn)行固定。2.3.2革蘭染色。用結(jié)晶紫對(duì)以上兩塊已固定的玻片進(jìn)行初染1分鐘，水洗；再用盧戈碘液媒染1分鐘，水洗；然后用95乙醇對(duì)其進(jìn)行脫色約20秒鐘，水洗；最后用稀釋復(fù)紅復(fù)染1分鐘，水洗；吸干，在顯微鏡下鏡檢。 83.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察。將糞便標(biāo)本用平半分區(qū)劃分法接種于伊紅美蘭培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)出紫黑色和粉紅色兩種菌落。(見圖一)10

6、3.2革蘭染色鏡檢。取紫黑色和粉紅色菌涂片，革蘭染色，進(jìn)行鏡檢。紫黑色菌革蘭染色陰性，長(zhǎng)桿狀。粉色菌革蘭染色陰性，短桿狀。（見圖二，圖三）113.3糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和半固體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)。紫黑色菌兩支單糖發(fā)酵微量管均變色和產(chǎn)氣，粉紅色菌葡萄糖發(fā)酵管變色不產(chǎn)氣泡，乳糖發(fā)酵管既不變色也不產(chǎn)氣泡。半固體實(shí)驗(yàn)中，紫黑色菌成模糊狀，粉色菌成清晰的線狀。（結(jié)果見圖四，圖五，表二）122.4藥敏試驗(yàn)。使用紙片瓊脂擴(kuò)散法，觀察抑菌圈的大小，由此判斷兩種菌的藥物敏感性（現(xiàn)象見圖六，圖七。結(jié)果見表3）142.5痢疾血清玻片凝集實(shí)驗(yàn)。紫黑色菌與痢疾血清混合不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而粉紅色菌與痢疾血清混合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉紅色菌是引起痢疾的致病菌。15 THE