革蘭氏陽性無芽孢桿菌的檢驗

1、革蘭氏陽性無芽孢桿菌的檢驗李氏桿菌屬（Listeria）產(chǎn)單核細胞李氏桿菌(L. monocytogenes)伊氏李氏桿菌(L.ivanovii)無害李氏桿菌(L.innocua)威斯梅爾氏李氏桿菌(L.Welshimeri)西里杰氏李氏桿菌(L.seeligeri)該屬代表種是產(chǎn)單核細胞李氏桿菌，引致人和動物的李氏桿菌病。流行病學(xué)分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播。寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲。一、形態(tài)與染色短小桿狀 , 革蘭氏染色陽性。不形成莢膜、無芽胞，有鞭毛，

2、20-25培養(yǎng)可產(chǎn)生4根周鞭毛，37至少可產(chǎn)生1根鞭毛。R型菌多為長絲狀。 在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀二、培養(yǎng)特性1、需氧或兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高；對NaCl 耐受力很強(18%)； 2、 1-45均可生長，30-37 最適， 4 需7天可生長 故稱“冰箱菌”；3、普通瓊脂平板：光滑型、藍綠色光澤菌落；4、麥康凱上不生長。5、血液葡萄糖瓊脂：圓形、光滑、淡藍色、透明、露滴狀菌落，狹窄溶血；6、半固體培養(yǎng)基穿刺: 沿穿刺線呈云霧狀生長。三、生化特性1、可分解多種糖：能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊苷、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖

3、；不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。2、接觸酶、MR、V-P試驗：3、 H2S、靛基質(zhì)、尿素酶、硝酸鹽還原、明膠液化、賴氨酸、鳥氨酸：4、石蕊牛乳在在24h微產(chǎn)酸，但不凝固。血清型具有O抗原（阿拉伯?dāng)?shù)字表示）及H抗原 （小寫英文字母表示）, 13個血清型，常見1a、2a、1b型。與多種細菌存在共同抗原，故血清學(xué)診斷意義不大。 四、抵抗力1 耐堿不耐酸，耐鹽。在土壤、牛奶、青貯飼料和糞便中長期存活；2 對熱的耐受性較多數(shù)無芽孢桿菌強，常規(guī)巴氏消毒法不能殺死該菌，在70 5-10min可被殺死；3 對消毒劑的抵抗力不強，常用消毒藥5-10min能殺死本菌：2

4、.5%石炭酸、70%乙醇、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林均可有效殺滅。五、致病性1、本菌細胞內(nèi)寄生，不被宿主細胞吞噬而破壞。產(chǎn)生的李斯特溶血素O（listeriolysin O, LLO）與其能在巨噬細胞內(nèi)生長有關(guān)。2、可自然感染多種家畜：豬、馬、牛、綿羊；3、病畜神經(jīng)癥狀，成年牛、羊往往表現(xiàn)為“轉(zhuǎn)圈病” ；4、妊畜流產(chǎn)、血液中單核細胞增多。5、雞可全身感染，心肌壞死。 6、成人腦膜炎，新生兒腦膜炎(10%)。六、微生物學(xué)診斷1. 鏡檢：肝、脾、腦組織等涂片、革蘭氏染色鏡檢可見G呈字排列的小桿菌。2. 分離培養(yǎng)：普通瓊脂平板藍綠光澤的菌落，接種血液葡萄糖瓊脂，露滴狀菌落，溶血。3. 純培養(yǎng)

5、：溶血檢查、運動性檢查、生化鑒定。4. 動物試驗 ：病料接種家兔或豚鼠眼內(nèi)，1d后發(fā)生結(jié)膜炎，不久敗血癥死亡；小鼠腹腔注射，剖檢肝臟壞死，分離細菌；妊娠2w的動物接種后可發(fā)生流產(chǎn)。5. 血清學(xué)檢查 ：凝集反應(yīng)。 七、檢測程序- 增菌目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、 Fraser肉湯（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buffered Listeria enrichment broth） 半量Fraser肉湯和Fras

6、er肉湯具有選擇性和區(qū)別性。加入檸檬酸鐵銨和七葉苷，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉苷，與培養(yǎng)基中的鐵離子反應(yīng)，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用的添加劑一樣半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黃12.5mg/L；Fraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃的25mg/L UVMUVM只有選擇性沒有區(qū)別性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉苷，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反應(yīng)。LEB和BLEB只有選擇性沒有區(qū)別性LEB

7、是在TSB-YE的基礎(chǔ)上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入的丙酮酸鈉，有助于受損細胞的恢復(fù)；不含七葉苷和檸檬酸鐵銨，無顏色反應(yīng)。BLEB是在LEB基礎(chǔ)上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉檢測程序-分離分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首選仍然是OXA。分離原理主要是基于李斯特氏菌具有D葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉苷，產(chǎn)生七葉素，與鐵離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)而，使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應(yīng)還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagar listeria、RapidL. mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。檢測程序-鑒定藍色菌落檢驗（Henry illumination）典型運動：相差顯微鏡，輕微旋轉(zhuǎn)或翻跟頭動力試驗：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗：穿刺