電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷課件

1、電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷 小組成員 李麗潔 宋慧芳 孟 晶 宋 晶 張艷輝 指導(dǎo)教師 吳 巖 教授 2007級(jí)電子顯微鏡技術(shù)碩士研究生課程電鏡的起始電子顯微鏡誕生于30年代初,但直到60年代以前,電子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要限于細(xì)胞生物學(xué)、微生物、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)等研究領(lǐng)域。60年代初期人們開始將電子顯微鏡應(yīng)用于人體病理標(biāo)本,通過對這些人體病理標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)分析,人們進(jìn)一步了解了疾病的病理變化及其發(fā)生機(jī)制,也同時(shí)認(rèn)識(shí)到電鏡做為一個(gè)新的診斷工具可直接為臨床服務(wù),為某些疾病的診斷提供重要的形態(tài)依據(jù)。60年代、70年代是國際上診斷電鏡發(fā)展的黃金時(shí)代,越來越多的疾病通過電鏡檢查而得到確診,越來越多的病理學(xué)

2、家認(rèn)識(shí)到了電鏡診斷的價(jià)值,電鏡逐漸成為病理診斷的一個(gè)基本工具,歐美國家中幾乎所有大的醫(yī)療中心及醫(yī)院都將電子顯微鏡用于疾病的研究和診斷。電子顯微鏡在腎活檢診斷、疑難腫瘤的病理診斷、感染性疾病(病毒性,細(xì)菌性等)、代謝性疾病(貯積性疾病)、細(xì)胞外物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉樣變性)、組織細(xì)胞增生癥(郎格罕細(xì)胞增生性疾病)、纖毛運(yùn)動(dòng)不能綜合征等特殊疾病的診斷中公認(rèn)起著重要的作用。幾種常用電鏡技術(shù)1. 1常規(guī)電鏡技術(shù)標(biāo)本經(jīng)固定后用m icro slicer 切片以增加樣品量, 取其中一部分(其余切片繼續(xù)保存) 做快速常規(guī)包埋、定位及超薄切片, 用透射電鏡觀察, 整個(gè)過程2 3 d。有些特殊結(jié)構(gòu)在器官組織中分

3、布很少, 而對于疾病診斷又很有意義。本方法是先切大量半薄切片, 在光鏡下先找到這些特殊結(jié)構(gòu)(必要時(shí)可用美藍(lán)染色) , 然后再做原位包埋、超薄切片, 透射電鏡觀察。雖然將光鏡和電鏡的結(jié)果結(jié)合起來分析增加了技術(shù)難度, 但可使疾病的電鏡病理診斷結(jié)果更全面、可靠。(1) 酸性磷酸酶, 主要定位于溶酶體及高爾基體, 是兩者的標(biāo)志酶; (2) 葡萄糖262磷酸酶, 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜, 是兩者的標(biāo)志酶; (3) 琥珀酸脫氫酶, 定位于線粒體內(nèi)膜, 是其標(biāo)志酶; (4) 髓過氧化物酶, 定位于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的線粒體、核膜、高爾基體及胞質(zhì)顆粒, 在原始細(xì)胞階段的白血病可依靠該酶來進(jìn)行細(xì)胞分型和鑒別診斷; (

4、5) 血小板過氧化物酶, 定位于巨核細(xì)胞的核膜、線粒體及致密管道系統(tǒng), 對巨核細(xì)胞性白血病的診斷有重要作用。1. 3免疫電鏡技術(shù)主要有兩種: 一種是免疫凝集電鏡技術(shù), 一般是抗原、抗體凝集經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察, 多用于診斷病毒性感染疾病。另一種是免疫電鏡定位技術(shù), 是用標(biāo)記物標(biāo)記后定位, 常用標(biāo)記物有3 種2:1.4掃描電鏡技術(shù)可觀察到組織及細(xì)胞表面結(jié)構(gòu), 適用于較大范圍內(nèi)觀察病變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu), 在白血病細(xì)胞分類中起重要作用。如毛細(xì)胞性白血病, 除了在細(xì)胞內(nèi)找到典型的板層體外, 另一個(gè)特征是細(xì)胞表面有大量多而長的微絨毛突化可以分析和判斷對疾病的治療情況。另外遺傳性口形細(xì)胞增多癥可利用掃描電鏡分

5、型, 為臨床治療提供依據(jù)。免疫組織化學(xué)技術(shù)與電鏡的比較進(jìn)入80年代后,免疫組織化學(xué)技術(shù)開始引入病理診斷。由于此項(xiàng)技術(shù)的不斷改進(jìn),特異性及敏感性逐漸得到改善,操作技術(shù)不斷地簡化并規(guī)范化,又由于單克隆技術(shù)的發(fā)展使得大量有診斷價(jià)值的抗體得以臨床應(yīng)用,因此這項(xiàng)技術(shù)很快便在人體各種疾病,尤其在腫瘤的診斷中廣泛開展起來,直至今日方興未艾。當(dāng)時(shí)許多人認(rèn)為人類疾病的診斷進(jìn)入了免疫組化的時(shí)代,免疫組化將取代電子顯微鏡成為人類疾病診斷的一個(gè)重要的手段。不少醫(yī)療單位越來越忽視電鏡在疾病研究、診斷中的作用,甚至錯(cuò)誤地認(rèn)為今后的疾病診斷將不再需要電子顯微鏡的助,有了操作簡單、快捷、費(fèi)用低廉的免疫組化技術(shù)以及近年來發(fā)展起

6、來的分子雜交、PCR、細(xì)胞基因分析等更加先進(jìn)的診斷技術(shù),足以解決人體疾病診斷中的難題。進(jìn)一步簡化,改進(jìn)電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、膠體金免疫電鏡技術(shù)等,不但保持其原來的特異性、敏感性,更要降低對標(biāo)本的要求,更適應(yīng)于臨床的需要,使得這些技術(shù)能更廣泛地應(yīng)用于常規(guī)電鏡診斷。其次,除了進(jìn)一步拓寬常規(guī)透射電鏡、掃描電鏡、電子能量色散譜、微區(qū)電子衍散等。在人體疾病診斷中的應(yīng)用范圍,還要積極地將掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡等新型的超顯微鏡引入到人體疾病的研究及診斷中,開拓病理診斷的新領(lǐng)域。除了開展活檢、外檢組織的電鏡檢查,還要積極開展細(xì)胞學(xué)的電鏡檢查。在我國,電子顯微鏡以往主要建立于大專院校及科研究院(所),部分電

7、鏡工作者缺乏電鏡診斷的經(jīng)驗(yàn),而臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生往往又缺乏電鏡知識(shí),忽視電鏡在疾病診斷中的作用。因此,要推動(dòng)我國電鏡診斷的進(jìn)一步發(fā)展,積極進(jìn)電鏡工作者、病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生之間的協(xié)作及溝通顯得尤為重要。電鏡在疾病診斷中的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域中, 運(yùn)用電鏡技術(shù)觀察研究生物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)已有近半個(gè)世紀(jì)歷史, 而將電鏡技術(shù)用于臨床研究和疾病診斷也有近四十年時(shí)間。幾十年來電鏡作為一種先進(jìn)手段, 在醫(yī)學(xué)科學(xué)的研究和臨床疾病診斷方面作出了重大貢獻(xiàn)。1.電鏡對病毒性疾病的診斷病毒性疾病的診斷離不開電鏡,電子顯微術(shù)是確定各種病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)最有用的工具。傳統(tǒng)的超薄切片可供觀察感染細(xì)胞內(nèi)病毒的大小、形態(tài)、排列及其復(fù)制組裝

8、、成熟的過程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵體的形態(tài)特征3。依據(jù)電鏡下病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,包括衣殼的對稱性、殼微粒數(shù)和排列方式、核衣殼在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制組裝的部位、病毒體的形態(tài)和大小以及螺旋對稱核衣殼的直徑等,再結(jié)合病毒的核酸和蛋白分子生物學(xué)特性,可以對致病病毒進(jìn)行鑒定和分類。電鏡負(fù)染技術(shù)是一種快速簡便的操作程序,也是病毒性致病因子電鏡診斷常用的方法,在新病毒的發(fā)現(xiàn)中作出了重要貢獻(xiàn)。免疫電鏡技術(shù)的應(yīng)用更提高了病毒快速診斷的敏感性和特異性4。另外,電鏡技術(shù)對研究某些病毒感染的發(fā)病機(jī)理也很有幫助。例如新近Geisbert等5報(bào)道了馬爾堡出血熱病人的電鏡觀察結(jié)果是先前無人報(bào)道過的。他們發(fā)現(xiàn)在胰島

9、中有病毒感染,在其他中,巨噬細(xì)胞是最早受病毒攻擊的靶細(xì)胞。肝細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞以及纖維母細(xì)胞也是病毒復(fù)制的重要部位。2.電鏡對腫瘤的診斷病理科醫(yī)生對腫瘤的診斷,主要依賴于光鏡,輔以免疫組織化學(xué)等技術(shù)。一般講,使用這些技術(shù),絕大部分腫瘤都得以明確診斷。但有些腫瘤的診斷及鑒別診斷,電鏡所起的作用很大,如無色素性黑色素瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、嗜酸細(xì)胞瘤、肌源性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等6。電鏡對下列腫瘤的鑒別診斷可起到重要作用:區(qū)別癌、黑色素瘤和肉瘤;區(qū)別腺癌和間皮瘤;在前縱膈腫瘤中可區(qū)別胸腺瘤、胸腺類癌、惡性淋巴瘤和生殖細(xì)胞瘤;在小圓細(xì)胞瘤中可區(qū)別神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胚胎性橫紋肌瘤、Ew

10、ing氏肉瘤、惡性淋巴瘤和小細(xì)胞癌;在軟組織梭形細(xì)胞瘤中可區(qū)別纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤和惡性神經(jīng)鞘瘤;區(qū)別梭形細(xì)胞癌和癌肉瘤7。3.電鏡對非腫瘤性疾病的診斷電鏡對各器官系統(tǒng)疾病的病理診斷,在許多單位受到重視,但用得最多的是腎臟活檢和某些皮膚疾病的診斷。對腎臟病的診斷,通常將光鏡、免疫熒光光鏡和電鏡觀察三者結(jié)合。4.電鏡獲得的信息對光鏡診斷結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充或修正臨床上,有時(shí)僅靠光鏡難以對疾病明確診斷,而電鏡具有高分辨性能,可以獲得許多不為光鏡捕捉到的信息,往往就是這些信息,為疾病的正確診斷提供了寶貴的資料,甚至修正光鏡的診斷結(jié)論。Wills等9對200例病例進(jìn)行了光鏡診斷和電鏡診斷的

11、結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)有15%的病例靠電鏡提供新的信息得以診斷。圖1a ,1b Merkel 細(xì)胞癌胞漿內(nèi)有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。Bar = 015m ,012mFig. 1a ,1b Neurosecretory granules in the cytoplasm of Merkel cell carcinoma. Bar = 015m ,012m電鏡的展望新世紀(jì)來臨之際, 回眸過去的一百年中人類對疾病的認(rèn)識(shí)有了非常深刻的變化, 疾病診斷的技術(shù)手段也有了巨大的進(jìn)步, 這其中無疑包含了電子顯微鏡所作的偉大貢獻(xiàn)。有人指出的那樣:“沒有電子顯微鏡增添新的認(rèn)識(shí)和知識(shí), 就不可能有對疾病或病理過程的了解。時(shí)至今日,

12、 電子顯微鏡并未像某些人預(yù)測的那樣隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展而進(jìn)入了末日。相反, 近年來越來越多的事實(shí)證明電鏡在人體各種疾病的診斷中仍然發(fā)揮著重要的作用。無疑, 對于許多非腫瘤性疾病, 由于常常無特異的抗原表達(dá), 因此其診斷仍依賴于特異的光鏡及電鏡形態(tài)表現(xiàn)。如腎活檢, 除了組織學(xué)特點(diǎn)外, 電鏡觀察還能揭示免疫復(fù)合物沉積的確切部位及形態(tài), 基底膜及各種細(xì)胞的變化等特點(diǎn), 這些仍然是重要的診斷依據(jù), 因此腎活檢標(biāo)本目前都常規(guī)地進(jìn)行電鏡檢查。通過檢測各種細(xì)胞器、肌絲的變化及特殊的超微結(jié)構(gòu), 電鏡對許多代謝性疾病、細(xì)胞內(nèi)外異常物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉性變性)、肌病的診斷也還起著關(guān)鍵的作用而這些疾病目前尚無法

13、采用免疫組化的方法來診斷。對于許多感染性疾病, 目前國內(nèi)外雖然已建立了免疫學(xué)或PCR 等診斷技術(shù), 但在不知道具體病原體的情況下, 電鏡檢查仍然是最快捷、可靠的診斷手段。此外, 由于不少病原體(如病毒, 弓形蟲等) 在電鏡下具有明確可靠的形態(tài)特點(diǎn), 易于辨認(rèn), 而免疫學(xué)及PCR 檢測可出現(xiàn)程度不等的假陰性或假陽性, 因此電鏡檢查目前仍公認(rèn)為最可靠的診斷技術(shù)10。參考文獻(xiàn)1.顏永碧, 陸月良, 王英 電鏡技術(shù)在病理學(xué)診斷中的應(yīng)用 J第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2003 年6 月, 第24 卷2.鄭尊,于秉學(xué),陳德蕙 電鏡診斷學(xué)的興起與發(fā)展J 電子顯微學(xué)報(bào) 1999 年6 月第18 卷第3 期3.劉復(fù)生, 司徒銳, 宗永生1 我國常見腫瘤病理學(xué)進(jìn)展1 中華病理學(xué)雜志, 1995, 242072094.周曉軍, 張?zhí)?223 例腫瘤的電鏡診斷研究1 中華病理學(xué)雜志, 1990, 191791815.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院主編1 醫(yī)學(xué)生物學(xué)電子顯微鏡圖譜1 北京: 科學(xué)出版社, 1978.6.鐘慈聲主編1 細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)1 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 19847.第二軍醫(yī)大學(xué)電鏡室、復(fù)旦大學(xué)生物系電鏡室編1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及功能1 上海: 上?？萍汲霭嫔? 1981.8.劉復(fù)生. 腫瘤病理學(xué)電鏡圖譜. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1995.9. Wills Subcla