第六章獸藥殘留檢測技術苯并咪唑類課件

1、第六章 獸藥殘留檢測技術第七節(jié) 苯并咪唑類藥物殘留的危害分析與檢測方法 第六章 獸藥殘留檢測技術第七節(jié) 苯并咪唑類藥物殘留的危害一、概述苯并咪唑類(Benzimidazoles，BEN)是一種驅(qū)蟲劑,被廣泛應用于動物寄生蟲的治療,同時還作為殺霉菌劑應用于莊稼存貯和運輸期間,使其免受霉菌污染。自20世紀60年代早期,美國合成噻苯達唑以來,已合成數(shù)百種苯并咪唑類驅(qū)蟲藥。噻苯達唑作為第一個商品化的苯并咪唑類藥物,曾廣泛用于世界各地,用以驅(qū)除各種動物(如牛、綿羊、山羊、豬、馬、禽等)胃腸道寄生蟲。用于治療時可一次內(nèi)服給藥,也可以低濃度置于飼料中長期使用做預防用。一、概述苯并咪唑類(Benzimidaz

2、oles，BEN)是由于噻苯達唑驅(qū)蟲作用不強,用藥劑量較大,且驅(qū)蟲譜不廣,目前,已逐漸為其他苯并咪唑類藥物阿苯達唑、奧芬達唑、芬苯達唑、甲苯達唑、氟苯達唑等所取代。本類藥物的特點是驅(qū)蟲譜廣,驅(qū)蟲效果好,毒性低,甚至還有一定的殺滅幼蟲和蟲卵作用。苯并咪唑類中的帕苯達唑、坎苯達唑、阿苯達唑和奧芬達唑?qū)θ焉镌缙?約妊娠三周)綿羊的胎兒有致畸作用,因此用于孕畜時應特別慎重。由于噻苯達唑驅(qū)蟲作用不強,用藥劑量較大,且驅(qū)蟲譜不廣,目前,苯并咪唑類藥物的結(jié)構式苯并咪唑類藥物是一個龐大的化學家族,包括噻苯達唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯類,以及苯并咪唑環(huán)上的各種側(cè)鏈取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯類苯并咪唑環(huán)噻苯達

3、唑的同系物苯并咪唑類藥物的結(jié)構式苯并咪唑類藥物是一個龐大的化學家族,包苯并咪唑類藥物1、噻苯達唑(Thiabendazole, TBZ)2、坎苯達唑(Cambendazole, CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太爾(Febantel, FEB)5、芬苯達唑(Fenbendazole, FBZ)6、奧芬達唑(OxfendazoIe, OFZ)7、阿苯達唑(Albendazole, ABZ)8、甲苯達唑(Mebendazole, MBZ)9、奧苯達唑(Oxibendazole, OXI)10、氟苯達唑(Flubendazole, FLU)11、三氯苯達唑(Triclabend

4、azole, TCB)苯并咪唑類藥物1、噻苯達唑(Thiabendazole, T1、噻苯達唑(Thiabendazole,TBZ)別名噻菌靈、特克多、涕必靈、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪,為白色至奶黃色粉末,無臭,味微苦,微溶于水或乙醇,易溶于稀鹽酸或稀堿液中,不溶于氯仿或苯中。廣譜驅(qū)蟲藥,可能是抑制蟲體的延胡索酸還原酶。對動物多種胃腸道線蟲均有驅(qū)除效果,對成蟲效果好,對未成熟蟲體也有一定作用。內(nèi)服吸收快,廣泛分布于各組織中。豬、羊、牛給藥后27h達血藥峰濃度。在體內(nèi)迅速代謝成5-羥噻苯達唑(5-OH-TBZ)1、噻苯達唑(Thiabendazole,TBZ)別名噻菌靈犢牛用藥后,腎中藥物濃度

5、最高,但肝的滯留期比腎長;噻苯達唑、5-羥噻苯達唑在肝和腎中的殘留量分別為57g/kg、581g/kg和153g/kg、19g/kg；休藥6天只有肝中有5-羥噻苯達唑殘留量(63g/kg)；噻苯達唑在肌肉和脂肪中未被檢出，但5-羥噻苯達唑在用藥后1日內(nèi)可檢出,其殘留量分別為肌肉54g/kg、脂肪64g/kg。奶牛用藥后12h,噻苯達唑、5-羥噻苯達唑在奶中的殘留量分別為5007g/kg和168g/kg，84h時分別為20g/kg和25g/kg。犢牛用藥后,腎中藥物濃度最高,但肝的滯留期比腎長;噻苯達唑、2、坎苯達唑(Cambendazole,CAM)別名噻苯達唑酯,為廣譜驅(qū)蟲藥。對動物腸道寄生

6、蟲和肺蠕蟲有明顯作用。制劑有混懸劑、糊劑或飼料粉的形式。內(nèi)服后在體內(nèi)迅速代謝,原藥和代謝物主要經(jīng)膽汁排泄,尿中占給藥量的25%,其中原形的不足5%。牛內(nèi)服后30日內(nèi),肝中可檢出殘留物,其中一部分為結(jié)合態(tài)?？脖竭_唑有致畸性,因此休藥期要求適當?shù)难娱L。牛休藥期21天,羊休藥期28天。2、坎苯達唑(Cambendazole,CAM)別名噻苯達唑3、苯硫脲酯(Thiophanate)別名硫菌靈、硫苯尿酯,屬苯并咪唑的前體藥物,即在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而發(fā)揮驅(qū)蟲作用。本品為微黃棕色結(jié)晶性粉末,在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶,在環(huán)己酮中易溶。動物制劑有混懸劑和丸劑兩種,或用作飼料添加劑。廣

7、譜驅(qū)蟲藥,對大多數(shù)動物的胃腸線蟲成蟲及幼蟲均有良好效果。內(nèi)服吸收快而完全,8h達血藥峰濃度。用藥后24h,幾乎能從所有組織器官中(特別是肝、腎)測出藥物。用藥后72h內(nèi),大部分藥量經(jīng)糞和尿排出體外。3、苯硫脲酯(Thiophanate)別名硫菌靈、硫苯尿酯,畜禽用藥后,殘留量在肝和腎中較高,而其他可食組織中相對較低。綿羊一次內(nèi)服100mg/kg后休藥1日,肝、腎、肌肉和脂肪中的殘留量分別為930g/kg、1060g/kg、670g/kg和2930g/kg;休藥3日后均低于100g/kg。犢牛一次內(nèi)服100mg/kg后休藥7日,肝、腎和肌肉中的殘留量均低于200g/kg。豬一次內(nèi)服75mg/kg

8、后休藥1日,肝、腎、肌肉和皮/脂肪中的平均殘留量分別為5550g/kg、6600g/kg、2600g/kg和16200g/kg;休藥3日分別為180g/kg、100g/kg、腎脂肪肌肉。牛內(nèi)服后18h,肝中約占總殘留量的90%,其中芬苯達唑30%5、芬苯達唑(Fenbendazole, FBZ)別名硫苯達唑、苯硫達唑，無臭無味，在二甲基亞砜中溶解，在甲醇中微溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。為廣譜、高效、低毒的新型苯并咪唑類驅(qū)蟲藥。它不僅對動物胃腸道線蟲成蟲、幼蟲有高度驅(qū)蟲活性,而且對網(wǎng)尾線蟲、矛形雙腔吸蟲、片形吸蟲和絳蟲亦有較佳效果。芬苯達唑在國外,不僅用于各種動物,甚至還有野生動物的專用制劑

9、。由于芬苯達唑溶解度較低,因而給動物內(nèi)服時吸收極少,如給綿羊、牛、豬內(nèi)服因吸收少,經(jīng)糞便排泄的原形藥約占44%50%,而經(jīng)尿排泄的不足1%。5、芬苯達唑(Fenbendazole, FBZ)別名硫苯達吸收后芬苯達唑在動物體內(nèi)迅速代謝為芬苯達唑亞砜(FBZ-SO)即奧芬達唑(OFZ)、芬苯達唑砜(FBZ-SO2)、芬苯達唑-2-氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代謝物。原藥和代謝物主要經(jīng)膽汁排泄。在綿羊體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,由膽汁分泌后可再經(jīng)肝腸循環(huán)。豬用藥5mg/kg后休藥7天,肝中母藥殘留量為0.28mg/kg,其他無組織殘留。吸收后芬苯達唑在動物體內(nèi)迅速代謝為芬苯達唑亞砜(FBZ-S

10、O牛用藥10mg/kg后休藥2天,肝、腎、肌肉和脂肪中的母藥殘留量分別為8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和0.95mg/kg;休藥7天,只在肝中能檢測到殘留量0.67mg/kg。奶牛內(nèi)服10mg/kg后,1224h奶中芬苯達唑濃度達峰值,休藥7天降至100g/kg;12h芬苯達唑亞砜濃度達峰值,然后迅速下降,96h時未檢出;48h芬苯達唑砜濃度達峰值,96h時未檢出。鱒魚內(nèi)服后,在體內(nèi)部分代謝為奧芬達唑,并蓄積于魚皮中。母藥和奧芬達唑的消除期分別為96h和24h。芬苯達唑砜代謝物在魚體內(nèi)幾乎沒有。牛用藥10mg/kg后休藥2天,肝、腎、肌肉和脂肪中的母藥殘6、奧芬達唑(

11、OxfendazoIe,OFZ)別名磺唑氨酯,為白色或類白色粉末,有輕微的特殊氣味,在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。奧芬達唑為芬苯達唑的衍生物,屬廣譜、高效、低毒的新型抗蠕蟲藥,其驅(qū)蟲譜大致與芬苯達唑相同,但驅(qū)蟲活性更強。奧芬達唑與阿苯達唑同為苯并咪唑類中,屬內(nèi)服吸收量較多的驅(qū)蟲藥。但反芻獸吸收量明顯低于單胃動物,而且舍飼反芻獸比放牧時吸收量多。牛用藥后1018天,牛肝中殘留量從55.5g/kg降低至10g/kg。羊用藥后1024天,羊肝中殘留量從476g/kg降低至12g/kg。奶牛內(nèi)服2.5mg/kg后1天,奶中的殘留量為最高(0.49mg/kg),休藥8日則降低至0.005m

12、g/kg;在4872h內(nèi)奶中主要代謝物為芬苯達唑砜。休藥期為牛11天、羊21天,產(chǎn)奶期禁用。6、奧芬達唑(OxfendazoIe,OFZ)別名磺唑氨酯,7、阿苯達唑(Albendazole,ABZ)別名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,為白色或類白色粉末,無臭,無味,在丙酮或氯仿中微溶,在乙醇中凡乎不溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。高效廣譜驅(qū)蟲藥,系苯并咪唑類藥物中驅(qū)蟲譜較廣、殺蟲作用最強的一種,對各種線蟲、絳蟲均有高度活性,對蟲卵發(fā)育也有顯著抑制作用。因不溶于水,故在腸道內(nèi)吸收緩慢。7、阿苯達唑(Albendazole,ABZ)別名丙硫苯咪唑原藥在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為阿苯達唑亞砜(ABZ-SO)、

13、阿苯達唑砜(ABZ-SO2)和阿苯達唑-2-氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者為殺蟲的活性成分。在體內(nèi)分布量依次為肝、腎和肌肉占內(nèi)服后血藥達峰時間為24h,并且持續(xù)1524h。原藥與亞砜代謝物在血中的濃度極低,半衰期為8.510.5h。24h內(nèi)約85%的給藥量經(jīng)腎排出,13%隨糞排出。原藥在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為阿苯達唑亞砜(ABZ-SO)、牛和羊殘留消除研究表明,用藥后數(shù)日內(nèi)組織中的代謝物濃度變化很大,剛開始時主要為亞砜代謝物,接著是砜類和氨砜類代謝物。用藥后在日內(nèi)牛肝和牛腎中的殘留物有95%為結(jié)合態(tài),但羊組織中結(jié)合態(tài)代謝物很少。奶牛內(nèi)服10mg/kg后,12h奶中亞砜代謝物殘留量達峰值

14、,然后迅速下降,36h時未被檢出;24h砜類代謝物殘留量達峰值,但消除緩慢,需156h可排凈;氨砜代謝物在奶中的量很低,36h達峰值,消除期180h。其他代謝物在服后24h達峰值,48h時低于方法的檢測限,但消除期為156h。牛和羊殘留消除研究表明,用藥后數(shù)日內(nèi)組織中的代謝物濃度變化很8、甲苯達唑(Mebendazole, MBZ)別名甲苯咪唑,為白色、類白色或微黃色結(jié)晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中極微溶解,在水中不溶。為廣譜驅(qū)蟲藥,不僅對動物多種胃腸線蟲有高效,而且對某些絳蟲亦有良效,并且是為數(shù)不多治療旋毛蟲的良藥之一。甲苯達唑早在20世紀80年代已廣泛用于世界各國的

15、醫(yī)學和獸醫(yī)臨床。8、甲苯達唑(Mebendazole, MBZ)別名甲苯咪唑內(nèi)服后胃腸道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血漿、肝、肺等,血藥達峰時間為24h,半衰期2.55.5h。在動物肝內(nèi)很少代謝,代謝物為極性很強的羥基(MBZ-OH)和氨基代謝物(MBZ- NH2)。在2448h內(nèi)經(jīng)糞便排泄的原形藥物約占80%左右,經(jīng)尿排泄的約為5%10%。吸收后藥物,僅有極少量以脫羧基衍生物形式排泄。內(nèi)服后胃腸道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血漿、肝二、組織中苯并咪唑殘留和限量苯并咪唑類藥物在動物體內(nèi)的殘留物與藥物本身有關外,還與給藥途徑、靶組織和消除期有關。標志殘留定義為母體藥物及其主要

16、代謝產(chǎn)物的總和。阿苯達唑：ABZ用藥后,在停藥初期,殘留物主要為ABZ-SO和ABZ-SO2;而在較長的停藥期,主要殘留物為ABZ-NH2-SO2,因此標志殘留為ABZ-SO 、 ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2 的總和,以ABZ計。對FEB、FBZ和OFZ,標志殘留為FBZ、OFZ(FBZ-SO)，和FBZ-SO2的總和,以FBZ-SO2計。藥物消除研究表明,OFZ和FBZ-SO2是組織中最常見的殘留物。二、組織中苯并咪唑殘留和限量苯并咪唑類藥物在動物體內(nèi)的殘留物在蛋中, 氟苯達唑FLU標志殘留主要為母體藥物,而在鳥類和豬可食組織中標志殘留為FLU和FLU-HMET,因此以FLU和FL

17、U-HMET的總量來定義FLU的標志殘留。甲苯達唑MBZ標志殘留定義為MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2的總和,以MBZ計。殘留消除研究表明,MBZ-NH2和MBZ-OH是組織中最持久的殘留物,對最高殘留限量(MRL)的影響最大。噻苯達唑TBZ標志殘留定義為TBZ和5-OH-TBZ的總和。在動物可食組織中,TBZ的母體藥物是最常見的殘留物,但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯結(jié)合物為主要殘留。在蛋中, 氟苯達唑FLU標志殘留主要為母體藥物,而在鳥類和豬三氯苯達唑TCB標志殘留定義為TCB、TCB-SO和TCB-SO2的總和。TCB禁止用于泌乳期動物,由于TCB-SO2消除時間長,因此它可以作

18、為殘留監(jiān)測的目標化合物。奧苯達唑OXI標志殘留為母體藥物。其他苯并咪唑類藥物,如CAM、LUX、PAR和BEN,在歐盟禁止用于動物源食品,因此歐盟未規(guī)定MRL值。部分苯并咪唑類藥物的標志殘留和最高殘留限量(MRL)。三氯苯達唑TCB標志殘留定義為TCB、TCB-SO和TCB-部分苯并咪唑類藥物的標志殘留和最高殘留限量(MRL)部分苯并咪唑類藥物的標志殘留和最高殘留限量(MRL)三、樣品處理苯并咪唑類分子含咪唑環(huán)結(jié)構,兩個氮原子具有酸堿兩性,在適當?shù)膒H條件下,分子可以質(zhì)子化(pKa約56)或去質(zhì)子化(pKa約12)。在酸性或堿性條件下,大部分苯并咪唑類藥物可解離,易溶于水性溶劑,并被提取,然后

19、調(diào)節(jié)pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范圍內(nèi)都能電離,易溶于酸性或堿性的水溶液,乙酸乙酯很難將其抽提出來。三、樣品處理苯并咪唑類分子含咪唑環(huán)結(jié)構,兩個氮原子具有酸堿兩對于CAM、TCB和TCB代謝產(chǎn)物,它們都有兩個或更多的pKa,因此溶劑提取時,控制溶液的pH值尤為重要。三氯苯達唑(TCB)、三氯苯達唑硫化物(TCB-SO)、 TCB-SO2和CAM分別在pH7.310.9、5.09.0、3.88.0和7.411.1呈中性,因此,只有當pH7.48.0時,所有這些分子都呈中性。大部分苯并咪唑類藥物在pH8時都呈中性,當預測某些苯并咪唑類藥物的pKa約為8時,這時欲對這

20、些組分同時提取變得相當困難。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH8.6和8.3,以非電離形式存在。對于CAM、TCB和TCB代謝產(chǎn)物,它們都有兩個或更多的pK1、水解肝和奶樣中苯并咪唑類藥物與蛋白結(jié)合率較高,不易被有機溶劑提取,可先將樣品水解后再提取游離的藥物。常用的水解方法有酸水解和酶水解兩種。酸水解通常使用無機酸,例如用4moL/L鹽酸于80110 ,在14h即可完成水解。酸水解具有簡便、快速、水解完全等優(yōu)點,因而被廣泛采用。1、水解肝和奶樣中苯并咪唑類藥物與蛋白結(jié)合率較高,不易被有機酶水解酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專一地水解葡萄糖醛酸苷結(jié)合物,后者可水解硫酸酯

21、結(jié)合物。由于肝樣中通常存在上述兩種結(jié)合物,常使用-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于一定溫度下孵育1872h。與酸水解相比,酶水解比較溫和,一般不會引起藥物的分解,但有時水解不完全和實驗費用高是該法的缺點。酶水解酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專一Tocco等發(fā)現(xiàn)TBZ在尿和奶中的代謝產(chǎn)物主要是5-OH-TBZ與葡糖苷酸和硫酸酯結(jié)合物,結(jié)合物用-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L鹽酸回餾1h)水解,釋放出游離的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等對TBZ在蛋雞和奶牛中代謝產(chǎn)物進行了研究,發(fā)現(xiàn)結(jié)合物主要是硫酸酯結(jié)合物。Markus等對肝樣中的ABZ及

22、其相關代謝物的結(jié)合物用酸解方法進行水解,釋放出游離的ABZ-NH2-SO2。Coulet等對組織中的TBZ蛋白結(jié)合物用堿解方法水解。Tocco等發(fā)現(xiàn)TBZ在尿和奶中的代謝產(chǎn)物主要是5-OH-T2、提取及凈化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑類藥物的最常用方法,通常將水性溶液調(diào)節(jié)至適當?shù)膒H值,用水不相溶的有機溶劑提取。用酸溶液提取時,即包括了樣品的水解過程。由于苯并咪唑類藥物的極性和pKa差異很大,因此多殘留提取相當困難,即使對單一藥物,母藥及其代謝產(chǎn)物的同時提取亦難。2、提取及凈化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑類藥物的最常例如MBZ及其兩個代謝產(chǎn)物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈堿性,pKa分別是3.5和5.5,在pH7.5時,