基于基因組步移模塊的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

1、基于基因組步移模塊的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討摘要：由于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置相對獨(dú)立，缺乏關(guān)聯(lián)性、且實(shí)驗(yàn)項(xiàng) 目相對老舊、沒有緊跟生化技術(shù)發(fā)展前沿，針對性地開展了基因組步移的綜合性實(shí) 驗(yàn)教學(xué)模塊，將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)單元串 聯(lián)成一個(gè)有機(jī)整體。教學(xué)實(shí)踐證明，以基因組步移為主線的模塊化實(shí)驗(yàn)教學(xué)激發(fā) 了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高了學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力，拓寬了學(xué) 生的科研視野，進(jìn)而為學(xué)生將來走上工作崗位奠定了良好的科研基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)；綜合性實(shí)驗(yàn)；基因組步移；教學(xué)模塊Discussion on Biochemistry Experiment

2、 Teaching Based onGenome Walking ModuleAbstract: There are two outstanding problems in biochemistry experiment course. One is that experimental items are relatively independent and lack of relevance. The other is that the items are obsolescence which does not keep up with the development of cutting-

3、edge technologies. We have developed a comprehensive experimental teaching module of genome walking. The module is composed of extraction of genomic DNA, enzyme and ligation, primer design, PCR reaction. The teaching practice proves that the entire experiments stimulated interest of students in lear

4、ning, extended their scientific thinking, improves their ability of discovering, analyzing and solving problems. Furthermore, it has laid a good foundation for the students to go to work in the future.Key words： biochemistry experiment; comprehensive experiment; genome walking; teaching moduleo引言作為生

5、命科學(xué)的核心課程,生物化學(xué)主要是應(yīng)用 化學(xué)的理論和方法，在分子水平上闡明生物現(xiàn)象的一 門科學(xué)。它既是學(xué)習(xí)生命科學(xué)的基礎(chǔ)，又是研究生命本質(zhì)的前沿,在本科教學(xué)中起著舉足輕重的作用婦 o引言作為生命科學(xué)的核心課程,生物化學(xué)主要是應(yīng)用 化學(xué)的理論和方法，在分子水平上闡明生物現(xiàn)象的一 門科學(xué)。它既是學(xué)習(xí)生命科學(xué)的基礎(chǔ)，又是研究生命生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)通?？煞譃榛A(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和綜合 性實(shí)驗(yàn)。前者實(shí)驗(yàn)結(jié)果是已知的，學(xué)生只要按照既定 的實(shí)驗(yàn)步驟完成實(shí)驗(yàn)即可。學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng) 和思維水平的提高主要是依靠綜合性實(shí)驗(yàn)。而從實(shí)際 授課情況來看，多數(shù)院校的綜合性實(shí)驗(yàn)是獨(dú)立設(shè)立的，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間沒有銜接性和過渡性;而且多數(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)

6、 容老舊，沒有與前沿的生物化學(xué)技術(shù)接軌，學(xué)生的綜合 能力得不到提高S?；诖耍瑘F(tuán)隊(duì)成員以較為前沿的“基因組步移技 術(shù)”為主線，將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè) 計(jì)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等實(shí)驗(yàn)單元串聯(lián)成一個(gè)有 機(jī)整體，形成一個(gè)內(nèi)容相關(guān)、層第推進(jìn)、方法多樣的綜 合性實(shí)驗(yàn)，并且在實(shí)施過程中，可充分調(diào)動學(xué)生的能動 性，取得良好的授課效果。1課程設(shè)計(jì)1.1實(shí)驗(yàn)原理基因組步移是指通過分子生物學(xué)手段獲得已知核 酸序列的側(cè)翼未知序列技術(shù)，主要用于囪：根據(jù)目 標(biāo)基因的cDNA序列，克隆其啟動子序列和調(diào)控序列; 鑒定轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子的插入點(diǎn)；染色體測序中的 空隙填補(bǔ)等。目前，基于酶切連接的PCR法是最為常

7、 用的基因組步移方法。其原理是將基因組DNA用限 制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后用T4連接酶將接頭序列加 到酶切好的DNA片段上。根據(jù)已知基因的cDNA序 列設(shè)計(jì)兩條引物（SP1和SP2）,用SP1引物和已知的 API引物進(jìn)行第1輪PCR外擴(kuò);以外擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模 板，用SP2引物和AP2引物進(jìn)行第2輪PCR內(nèi)擴(kuò)，獲 得的PCR產(chǎn)物即為目的基因申。1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c材料本實(shí)驗(yàn)以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的類胰島 素促雄腺基因（Insulin-like androgenic gland hormone， IAG）為研究對象，通過基因組步移技術(shù)獲得Es-IAG 的5側(cè)翼序列。Es-

8、IAG基因的cDNA序列來源于前期 構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫（NCBI-SRA登錄號： SAMN06204640）山。1.3課程設(shè)計(jì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課授課對象為農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)專業(yè) 大三本科生。課程將項(xiàng)目內(nèi)容分解為5次課（見表1）， 包括4次實(shí)驗(yàn)課和1次匯報(bào)總結(jié)，課時(shí)數(shù)為12學(xué)時(shí)，除 PCR反應(yīng)為4學(xué)時(shí)外，其余均為2學(xué)時(shí),在固定的教學(xué) 時(shí)間段內(nèi)都可完成，適合本科生的課堂教學(xué)安排。為了 提高生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，安排2人1組。表1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排課次實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)材料及儀器1dna的提取2介紹dna提取實(shí)驗(yàn)的原理;組織樣品的破碎;混合液的 上柱過濾;dna清洗回收;凝膠檢測新鮮的組織樣品；離心機(jī)；

9、移液器；離心管;槍頭；水浴 鍋;瓊脂糖;凝膠檢測系統(tǒng)等2dna的酶切連接2介紹酶切連接的原理;dna酶切;溫浴;連接接頭接頭序列；限制性性內(nèi)切酶;T4連接酶；移液器；離心 管;迷你離心機(jī);水浴鍋等3引物設(shè)計(jì)2介紹引物設(shè)計(jì)的原則；primer premier 5. 0軟件的使用方 法;引物設(shè)計(jì)示范Es-IAG序列（起始密碼子ATG之前的序列）4PCR反應(yīng)4介紹PCR反應(yīng)的原理及各組分在PCR反應(yīng)中的作用； PCR儀的使用方法及程序設(shè)置；PCR反應(yīng)體系的配制； 凝膠檢測;外送克隆測序PCR儀;PCR反應(yīng)預(yù)混液；AP1、AP2、SP1、SP2引物；移 液器;瓊脂糖;凝膠檢測系統(tǒng)等5匯報(bào)總結(jié)2各組選派

10、代表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)總結(jié)熟悉各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并進(jìn)行相關(guān)點(diǎn)評2實(shí)驗(yàn)過程2.1 DNA的提取剪切中華絨螯蟹約20 mg的肌肉組織，勻漿破碎。 加入 200 ,L Buffer GA，20 ,L Proteinase K，55 C 溫 浴，將組織完全溶解。然后按dna提取試劑盒說明進(jìn) 行操作。2.2酶切加接頭將DNA進(jìn)行酶切，體系如下：基因組DNA 5 ,L, 內(nèi)切酶 1.6 ,L，Buffer 2 ,L，dd H2O 補(bǔ)足到 20 ,L。 37 C酶切過夜。將酶切后的DNA與接頭序列進(jìn)行連 接反應(yīng)，體系如下:酶切產(chǎn)物4.7 ,L,接頭2 ,L，Buffer 0.8 ,L，T4 連接酶 0.5 ,L，16 C

11、 孵育 1 h。2.3引物設(shè)計(jì)依據(jù)Es-IAG的cDNA序列,遵循引物設(shè)計(jì)的原則進(jìn)行SP1和SP2引物的設(shè)計(jì)。具體序列如表2所示。表2基因組步移的引物序列引物名稱引物序列SP1GCAGCATCTGGAAGGAAGGTGASP2CCATTTGTCCCATGTTCA2.4基因組步移的PCR反應(yīng)將連接液稀釋10倍后，取1 ,L作為第1輪反應(yīng) 的模板。用SP1于AP1配合進(jìn)行第1輪外擴(kuò)，然后取 外擴(kuò)產(chǎn)物稀釋100倍后，取2 ,L作為第2輪反應(yīng)的模 板。PCR 反應(yīng)體系如下:dd H2O 20.5 ,L,PCR Buffer 2.5 ,L,dNTP 0.5 ,L,AP 引物 0. 5 ,L,SP 引物

12、0.5 ,L,Polymerase Mix 0. 5 ,L。第 1 輪反應(yīng)程序如下:7 個(gè)循環(huán)：94 C 25 s,72 C 3 min,32 個(gè)循環(huán)：94 C 25 s,67 C 3 min,67 C終延伸7 min。第2輪反應(yīng)程序圖1圖1基因組步移結(jié)果如下:5個(gè)循環(huán)：94 C 25 s,72 C 3 min,20個(gè)循環(huán)： 94 C 25 s,67 C 3 min,67 C 終延伸 7 min。 瓊脂糖 檢測反應(yīng)產(chǎn)物，然后送公司測序m3。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果對各個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較后，選取典型的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。通過兩輪PCR步移反應(yīng),獲得約 1 000 bp的目的條帶（見圖1），將第2輪PCR

13、產(chǎn)物外 送測序，測序結(jié)果如圖2所示。Es-IAGAGGGAAAAAAAA GGAAAGGAAGC GTAGATAACAAAGG AGAAAGAT GAAAAG GGAGATGAAAAGAA AAAAG GGAGAAA GGAAATAAAAAATGGAAT GAAC TAAAAAAATAAATT TCT TTCT TTCT TTT TTC TTCCGTTCTTACTTTTTTCTCATTCTCTTTCTTTCTTTTCTATCTTTCTCTCTCTTTCTTCCTCT CTTTCTTTCTTTTTCTCTTTCTCTCTGTGTTTTTCATTGTAATTCTTTCTTTCTCATTTTCATT

14、T TTTCTTTCTTATTTCTTCCTTCCTTACTTTTTCTCTTTCTCTTTCTTTCCTTCTTTCTTTTCTAT CTTTCCCTCTCTTTCTTCCTCTCTTTCTCTTTTTCTCTATCTGTCCGTCTCTTTCTGTCTGTATG TTTTTCATTCTAAATATTTTTTTATCATTTTCTTTCTTTCTTAAAGGAACACGTGCCCTGCTTCT CAGCGTGAGGGGAGCTTGGCGCCGGGCGAGTCAGCACGGTCATACAATCGGTGGC TGCCGCGGCC TATCAAAACGGTCAAAACAAGGGGTACTTTTAG

15、SCACACAATGGCCTCCGCTGCCCGCTGGTGCC TCACGCGGGGTATATAACATGGGCGCGGCGTTTCCAGCCCTGCGGTGCGCCTCACAGCTGCTCAC GACACACGCCAATTTTCCTCTCGGCGCCTCCTTCACTTTACCTTAAATTAGTTTCCTTTCTTTGA CTTTCTTTGGAATACACCGTCTTCCTCCGCCTTTCCTTTCCTCGGCCGTCGCTTGAGGTGCACCG TCAAAGTCCTGTTCTCTGTCCCTTGCCACCTTTCAfi.CTTTTCTTCATTCTTCAACGAGGATGTCC C

16、TGCCTTCCGTCCTTCTGCTAGTGAGATGCCCGCCCCTCATGCACACATGCACACACTAAATATA TATAGTAGGACT GT T G T AAAT AT T T G AACA T GGG AC AAAT GGTC AT AA C AA TTCTTCTG C AC CCC ACCACACCTTTAATCACCTTCCTTCCAGATGCTGCTGACGGCCACAGCCACGAGGGCCCAGGACT GCAGCTTCTCCGTGGACTGTGCCAACCTGTTAGACTCCATGAACACTGTGTGCCGC圖2步移獲得的Es-IAG基因5側(cè)翼序列（引物用

17、灰色背景標(biāo)出，起始密碼子ATG用下劃線標(biāo)出）4教學(xué)反思4.1摒棄固有模式，“串”零為整無論動物、植物還是微生物,體內(nèi)的生化反應(yīng)都是 一個(gè)復(fù)雜有序的整體，都遵循“中心法則”。因此，應(yīng) 該從整體水平上來看待生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。傳統(tǒng)的生 物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課，往往都是獨(dú)立的單元，割裂了各單元之 間的聯(lián)系。這種單元化教學(xué)模式的后果往往使學(xué)生獲 得的知識也呈現(xiàn)單元化，沒有形成一個(gè)整體，進(jìn)而影響 了學(xué)生對生物化學(xué)理論知識的掌握，更無從談起靈活 運(yùn)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將基因組DNA 的提取、酶切連接、引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)單元 串聯(lián)成一個(gè)整體,既考慮了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法的關(guān) 聯(lián)性和完整性，又考慮了每個(gè)單

18、元的相對獨(dú)立性。在 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中,遵循循序漸進(jìn)的原則，按照“DNA提 取甫切慧接另I物設(shè)計(jì)-PCR反應(yīng)-測序”的順序,安排 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。上一個(gè)實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物是下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的原材 料,環(huán)環(huán)相扣,在DNA水平將上述單元聯(lián)系在一起,突 出了模塊教學(xué)的整體性,實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和教學(xué)方法 的有機(jī)融合。4.2立足發(fā)現(xiàn)、解決問題，開拓思維能力生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課除了提高學(xué)生的動手能力外，培 養(yǎng)學(xué)生的發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力也是實(shí)驗(yàn)課的目 標(biāo)之一。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)之前，指導(dǎo)教師都引導(dǎo)學(xué)生閱讀 相關(guān)的文獻(xiàn)資料，做到對實(shí)驗(yàn)有較為清晰的理解，掌握 實(shí)驗(yàn)的基本原理，明確不同試劑在實(shí)驗(yàn)中的作用。通 過查閱文獻(xiàn)使學(xué)生明確本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)中技術(shù)路線有何 不同,讓學(xué)生帶著問題走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，如在DNA提取實(shí) 驗(yàn)中，學(xué)生的問題主要為柱式提取法與傳統(tǒng)的酚仿的 不同點(diǎn);在酶切連接環(huán)節(jié),問題為完全酶切和不完全酶 切對本次實(shí)驗(yàn)是否有影響;在基因組步移環(huán)節(jié),問題為 基于PCR技術(shù)的基因組步移方法有哪幾種;每種方法 各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么。所有的問題都在匯報(bào)環(huán)節(jié)集中 解決，先由學(xué)生自己根據(jù)所掌握的知識給出相應(yīng)的答 案,如有不妥之處，由指導(dǎo)教師答疑釋惑。因此，模塊 化的實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置體系和循序漸進(jìn)的教學(xué)方式，不但 可以使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中變被動為主動，發(fā)揮主觀能 動性，逐步提高發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能 力；而且還可以增強(qiáng)團(tuán)隊(duì)意識和協(xié)作能力。5結(jié)語生物化