胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制及方法

1、胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制及方法【摘要】胚胎干細(xì)胞是來(lái)源于附植前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或附植后胎兒的原始生殖細(xì)胞具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。近年來(lái)在胚胎干細(xì)胞分化機(jī)制研究和定向誘導(dǎo)分化方面都有長(zhǎng)足進(jìn)展，但其分化機(jī)制和定向分化的方法一直是人們需要解決的難點(diǎn)問(wèn)題，本文主要就胚胎干細(xì)胞的定向分化機(jī)制、方法及目前存在的問(wèn)題等方面進(jìn)展概括性闡述?！娟P(guān)鍵詞】胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制方法【Abstrat】Ebrynisteellisakindfundifferentiatedpluriptentsteell,hihstesfrprEiplantatinIrearlyfetusprirdialgerell.Theresearha

2、butdifferentiatinfebrynisteellhasbeenahtsptinedialfieldn,buttheehanisfdifferentiatinandthediretinaldifferentiatinhaventknnveryell.Reently,therearedraatidevelpentsinthesefields,thispaperelabratedtheehanissdifferentiatinnindueddifferentiatinfebrynisteells,ethdsnindueddifferentiatinfebrynisteells,quest

3、insnindueddifferentiatinfebrynisteells.【Keyrds】ebrynisteell;indueddifferentiatin;ehanis;ethd自1981年英國(guó)的Evans等從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)Innerellass，I別離建立胚胎干細(xì)胞Ebrynisteells，ES細(xì)胞以來(lái)，ES細(xì)胞的研究就一直是各國(guó)研究的熱點(diǎn)。近兩年，ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)以及調(diào)控方面的研究獲得了很多重要的進(jìn)展，已從ES細(xì)胞誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管和內(nèi)皮細(xì)胞等。利用ES細(xì)胞的定向分化可望在基因研究、細(xì)胞治療和組織器官替代治療等的研究中發(fā)揮重要作用。1ES細(xì)胞定向分化的調(diào)節(jié)機(jī)制自19

4、88年發(fā)現(xiàn)了白血病抑制因子能抑制ES細(xì)胞分化后，人們就開(kāi)場(chǎng)研究其定向分化，通過(guò)將外源基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞研究其表達(dá)及微環(huán)境對(duì)細(xì)胞分化的影響，認(rèn)為ES細(xì)胞的分化受內(nèi)源性因素和外源性因素的共同調(diào)節(jié)。分化機(jī)制如下。1.1內(nèi)源性影響因素內(nèi)源性因素即不同基因在不同時(shí)間和空間的開(kāi)啟和關(guān)閉及各種轉(zhuǎn)錄因子等。從分子程度來(lái)看，ES細(xì)胞分化的本質(zhì)問(wèn)題是基因表達(dá)調(diào)控。1.1.1基因的差異表達(dá)在個(gè)體發(fā)育中，基因按照一定程序，有選擇地相繼活化的現(xiàn)象稱為基因的差異表達(dá)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中所以能相繼分化出各種新類型細(xì)胞，就是由于相關(guān)基因相繼活化而合成特異蛋白質(zhì)的結(jié)果。rss等1研究證明細(xì)胞定型時(shí)是通過(guò)強(qiáng)化某些基因的表達(dá)并抑制另一

5、些基因的表達(dá)來(lái)形成某個(gè)單一譜系所特有的基因表達(dá)型。如缺乏干細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子的ES細(xì)胞不能分化為血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同的前體細(xì)胞。1.1.2基因的不同表達(dá)程度有些基因如t-4基因和Nang基因等在體內(nèi)通過(guò)不同的表達(dá)程度來(lái)調(diào)控ES細(xì)胞的分化。1.1.2.1通過(guò)t-4基因的不同表達(dá)程度調(diào)控ES細(xì)胞分化t-4基因是ES細(xì)胞的一個(gè)特異標(biāo)志分子。t-4是一種調(diào)節(jié)性基因，它的職責(zé)是控制其他基因的表達(dá)。無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，t-4基因只在全能或多能性細(xì)胞如ES細(xì)胞和EG細(xì)胞中表達(dá)。t-4基因的敲除使小鼠胚胎不能形成I，而完全由滋養(yǎng)外胚層組成，并在植入時(shí)死亡。RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示t-4表達(dá)下調(diào)引起ES細(xì)胞分化，形

6、成滋養(yǎng)層或內(nèi)胚層，說(shuō)明t-4基因在維持胚胎細(xì)胞的發(fā)育全能性和ES細(xì)胞不分化狀態(tài)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Nia等2研究發(fā)現(xiàn)，t-4不同的表達(dá)程度指導(dǎo)ES細(xì)胞的3種不同命運(yùn)，即t-4表達(dá)上調(diào)2倍使ES細(xì)胞分化為原始內(nèi)胚層細(xì)胞，t-4表達(dá)下調(diào)使ES細(xì)胞分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞，t-4表達(dá)程度不變才能使ES細(xì)胞維持不分化狀態(tài)。因此，t-4被視為多能細(xì)胞發(fā)動(dòng)、維持及分化的主要候選調(diào)控因子。1.1.2.2Nang基因維持ES細(xì)胞的不分化狀態(tài)近年來(lái)在確定維持ES細(xì)胞不分化狀態(tài)相關(guān)基因方面最大進(jìn)展也許是Nang基因的發(fā)現(xiàn)3。Nang基因僅在ES細(xì)胞中特異表達(dá)，在分化的ES細(xì)胞和體細(xì)胞中不表達(dá)；Nang基因缺陷的ES細(xì)

7、胞失去多能性，開(kāi)場(chǎng)分化；導(dǎo)入了Nang基因的ES細(xì)胞株在LIF拮抗劑存在時(shí)仍能保持30%的不分化ES細(xì)胞。Nang在桑葚胚等全能胚胎中不表達(dá)，僅在囊胚期的I中表達(dá)，之后限制在晚期囊胚的外胚層表達(dá)，胚胎植入后Nang的表達(dá)迅速降低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還說(shuō)明Nang基因缺陷的胚胎僅包括一些不能識(shí)別的胚外組織，而沒(méi)有外胚層或胚外外胚層。這些結(jié)果提示Nang是t-4基因啟動(dòng)后維持內(nèi)細(xì)胞團(tuán)全能性所必需的。Nang的作用機(jī)制目前尚不清楚。Nang基因只在ES細(xì)胞中發(fā)揮作用，在其他干細(xì)胞中那么處于休眠狀態(tài)，假如可以找出某種方法激活該基因，成體干細(xì)胞也許就能再次成為ES細(xì)胞。1.1.3奢侈基因某些基因?qū)?xì)胞自身生存并無(wú)

8、直接影響，不是必需的，但卻決定著細(xì)胞向特殊類型分化的物質(zhì)基矗如編碼肌細(xì)胞肌球蛋白的基因，編碼結(jié)締組織的膠原蛋白的基因等。ihael等4利用心肌細(xì)胞-肌球蛋白重鏈的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，結(jié)果獲得了99%的心肌細(xì)胞。1.1.4拯救因子和免疫“豁免特權(quán)研究人員發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞可以分泌出特殊的“拯救因子來(lái)逆轉(zhuǎn)小鼠的致死性的先天缺陷。盡管很少有干細(xì)胞真正長(zhǎng)成安康的心臟組織，但研究人員發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可以分泌出特殊的分子，這些分子能發(fā)出信號(hào)給臨近的心臟細(xì)胞從而修復(fù)先天缺陷器官的功能。另一個(gè)研究成果說(shuō)明人類ES細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫“豁免特權(quán)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在小鼠活體內(nèi)移植的未分化人類ES細(xì)胞不會(huì)引起移植排擠的特定免疫反響，這項(xiàng)

9、研究對(duì)人類ES細(xì)胞移植治療具有重要意義。1.1.5細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化中的作用細(xì)胞質(zhì)對(duì)ES細(xì)胞的分化方向起決定性作用。調(diào)節(jié)基因差異表達(dá)的物質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)中。每個(gè)子細(xì)胞所繼承細(xì)胞質(zhì)的差異決定了各子細(xì)胞沿特定的方向分化。1.2外源性因素外源性因素指細(xì)胞間的分化誘導(dǎo)、分化抑制作用及細(xì)胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用等。細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控作用是ES細(xì)胞發(fā)生分化的決定因素。但細(xì)胞所在的環(huán)境條件對(duì)ES細(xì)胞的分化也有重要影響。1.2.1細(xì)胞間的分化誘導(dǎo)細(xì)胞間的分化誘導(dǎo)是指一局部細(xì)胞對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生影響，并決定鄰近細(xì)胞分化方向及形態(tài)發(fā)生的過(guò)程。誘導(dǎo)分化的機(jī)制還不清楚，可能與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。如：hES細(xì)胞與鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系S17細(xì)

10、胞或卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞系166細(xì)胞共培養(yǎng)，在添加胎牛血清的條件下，hES細(xì)胞可分化為D34+的造血祖細(xì)胞。1.2.2細(xì)胞間的分化抑制細(xì)胞間的分化抑制是指在胚胎發(fā)育中，已分化的組織細(xì)胞產(chǎn)生抑素，抑制鄰近細(xì)胞進(jìn)展同樣分化以防止一樣的器官重復(fù)發(fā)生或過(guò)度發(fā)育。如：把發(fā)育中的蛙胚置于含成體蛙腦碎片的培養(yǎng)液中一起培養(yǎng)，胚胎那么不能發(fā)育成正常腦。1.2.3細(xì)胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用細(xì)胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用分近間隔 與遠(yuǎn)間隔 兩種，起近間隔 介導(dǎo)作用的主要是細(xì)胞外基質(zhì)與黏附分子，起遠(yuǎn)間隔 介導(dǎo)作用的主要是激素與細(xì)胞因子等。目前研究最多的是生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)hES細(xì)胞在體外分化，但沒(méi)有一種生長(zhǎng)因子能誘導(dǎo)hES細(xì)胞定向分

11、化為一種特定細(xì)胞。生長(zhǎng)因子僅僅是增加某一種類型細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。Shuldiner等5研究了8種生長(zhǎng)因子對(duì)hES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，發(fā)現(xiàn)：苯丙酸諾龍和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1主要誘導(dǎo)中胚層細(xì)胞形成；維甲酸、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)生成蛋白4和堿性成纖維生長(zhǎng)因子主要誘導(dǎo)外胚層和中胚層細(xì)胞的形成；神經(jīng)生長(zhǎng)因子主要誘導(dǎo)三胚層所有細(xì)胞的形成。2ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的一般方法ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是目前研究的熱點(diǎn)，人們通過(guò)不同的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。目前主要包括：外源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化、通過(guò)將ES細(xì)胞與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化等。2.1外源細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化在體外誘導(dǎo)ES

12、細(xì)胞分化方面，對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)法研究的最為廣泛和深化，獲得的研究成果到目前為止也最多。體外培養(yǎng)下，ES細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子具有依賴性。培養(yǎng)過(guò)程中添加或撤除某一種或某些細(xì)胞因子可指導(dǎo)ES細(xì)胞的增殖或分化。目前在發(fā)育學(xué)方面研究比擬深化的誘導(dǎo)因子主要有：維甲酸retiniaid，RA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白bnerphgenetiprteins，BPs、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子fibrblastgrthfatrs，F(xiàn)GFs等。利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞朝一定方向分化時(shí)，一般采用分階段的方法，即先得到類胚體ebryidbdies，EBs，再在EBs的根底上進(jìn)一步誘導(dǎo)使其分化為目的細(xì)胞。在各階段添加的細(xì)胞因子不同，詳細(xì)表現(xiàn)為細(xì)

13、胞因子種類、濃度或組合的不同。目前利用此法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已得到多種目的細(xì)胞，如：造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。2.1.1RA誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化RA系維生素A的衍生物，它可以影響脊椎動(dòng)物的發(fā)育和許多類型細(xì)胞的分化。RA不但可以通過(guò)經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化，還可以抑制LIF信號(hào)促進(jìn)ES細(xì)胞分化。RA常被用來(lái)進(jìn)展誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究。Strbing等6研究顯示，BL6和D3ES細(xì)胞自發(fā)分化產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞只占EB的1530，而用RA處理后EB中幾乎全部細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。Shuldiner等7證實(shí)，用高濃度RA10-6誘導(dǎo)人ES細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞比未用RA處理的增加2276:5

14、4%。目前RA誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制仍未說(shuō)明。已有報(bào)道指出，F(xiàn)GF信號(hào)通路在多種生物的胚胎神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用8。ilsn等9也證實(shí)，F(xiàn)GF信號(hào)可以通過(guò)抑制BPs表達(dá)，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞。此外，Ying等10發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF信號(hào)是ES細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)特異性分化所必需的。這些研究提示我們，RA誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制可能與FGF信號(hào)有關(guān)。2.1.2BPs誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化BPs是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子transfringgrthfatr，TGF-超家族成員中最大的一族，通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因活性，對(duì)中胚層形成、左右對(duì)稱、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、體節(jié)和骨骼發(fā)育、肢體形成及腎、胃腸、肺、牙齒的發(fā)育等根

15、本過(guò)程產(chǎn)生影響。BPs家族中，BP-2和BP-4在誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用。Kraer等11研究發(fā)現(xiàn)BP-2以時(shí)間依賴的方式增加EB向軟骨細(xì)胞分化，即在EB懸浮培養(yǎng)25日時(shí)參加BP-2可以誘導(dǎo)其分化，而在EB懸浮培養(yǎng)02日或59日時(shí)參加BP-2不產(chǎn)生作用。Li等12用猴ES細(xì)胞進(jìn)展體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將BP-4參加ES細(xì)胞培養(yǎng)體系中，分化產(chǎn)生的造血前體細(xì)胞集落增加了17倍。hadik等13證明了BP-4與造血細(xì)胞因子結(jié)合可以促進(jìn)人ES細(xì)胞向造血系統(tǒng)分化。此外，Xu等14的實(shí)驗(yàn)顯示BP-4還可以誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化成為滋養(yǎng)層細(xì)胞。2.1.3FGFs誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化FGF-2是纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子家

16、族成員，通過(guò)細(xì)胞外表的FGF受體FGFreeptr，F(xiàn)GFR調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育。FGFR屬于酪氨酸激酶受體家族的一類，至少有5個(gè)成員，其中FGFR-1和FGFR-2是FGF-2的高親和力的受體。FGF-2誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是正常細(xì)胞生長(zhǎng)分化所必需的，參與血管新生、胚胎發(fā)育、骨骼形成等生理過(guò)程。DelraP等15比擬了表達(dá)FGFR-1陽(yáng)性和FGFR-1陰性的ES細(xì)胞分化產(chǎn)生心肌細(xì)胞的才能，結(jié)果顯示來(lái)自FGFR-1陽(yáng)性ES細(xì)胞的EB，有90%細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞；而來(lái)自FGFR-1陰性ES細(xì)胞的EB，僅10左右細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。由此可見(jiàn)，F(xiàn)GFR-1對(duì)于體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞是必需的，F(xiàn)GF

17、/FGFR信號(hào)途徑在體外心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用。此外，有研究說(shuō)明FGF-2在某些情況下也可以誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化。FGF-3在原腸胚階段的胚胎中表達(dá)，F(xiàn)GF-3信號(hào)途徑可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，因此利用FGF-3也可以誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞特異分化。2.1.4其他細(xì)胞/生長(zhǎng)因子或化合物除以上幾種主要的誘導(dǎo)因子之外，其他一些細(xì)胞/生長(zhǎng)因子或化合物也能誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化，如造血生長(zhǎng)因子hepietigrthfatr，HGF可以增加ES細(xì)胞向中胚層分化，最終產(chǎn)生心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞等。用ativin-A處理分化5日的EB在最終的分化產(chǎn)物中出現(xiàn)大量肌細(xì)胞16。Sahinidis等17研究顯示TGF-可

18、以調(diào)節(jié)ES細(xì)胞向心肌分化。二甲基亞砜作為細(xì)胞保護(hù)劑，也可以促進(jìn)ES細(xì)胞向胚胎心臟細(xì)胞分化，誘導(dǎo)表達(dá)GATA-4和Nkx-2.518。另外有報(bào)道指出，多種細(xì)胞因子共同作用促進(jìn)ES細(xì)胞特異性分化的效率更高。Li等19用含有EGF、IGF-1和bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)EB10日，觀察到96%的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞特異性標(biāo)志，但需要說(shuō)明的是，在應(yīng)用這種策略時(shí)必須明確幾種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分化方向是一致的。2.2轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化的方法雖然操作簡(jiǎn)便，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生的成熟細(xì)胞數(shù)量較少，而且純度較低，不利于細(xì)胞移植治療。人們開(kāi)場(chǎng)嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因方法到達(dá)誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化，它主要是利用基因轉(zhuǎn)染技

19、術(shù)使某個(gè)促分化基因在ES細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，從而調(diào)節(jié)ES細(xì)胞的分化。轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化已經(jīng)獲得了較好的效果。主要表達(dá)在以下兩方面。2.2.1促分化基因?qū)胝T導(dǎo)ES細(xì)胞分化Viari和Shiang20報(bào)道，與添加FGF-2因子相比擬，利用單純皰疹病毒作為載體將FGF-2基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞是前者的三倍。Prelle等21研究胰島素生長(zhǎng)因子insulingrthfatr，IGF促進(jìn)鼠ES細(xì)胞肌分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未過(guò)表達(dá)IGF基因的ES細(xì)胞比照，過(guò)表達(dá)IGF是可以加速并增強(qiáng)ES細(xì)胞分化的。以上研究說(shuō)明IGF加速ES細(xì)胞向肌細(xì)胞分化是與改變了肌發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)程度有關(guān)。2.2.2特異

20、性轉(zhuǎn)錄因子異位表達(dá)誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子異位表達(dá)就是將細(xì)胞系特異表達(dá)基因?qū)隕S細(xì)胞，并使其表達(dá)，產(chǎn)生特異性轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞系特定轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)可誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為目的細(xì)胞系。例如，成肌細(xì)胞決定基因yD同源異型基因B4和11HxB4和Hx11的組成型異位表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞分化為肌肉細(xì)胞22、造血細(xì)胞23。然而ES細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)分化基因的組成型表達(dá)可能對(duì)ES細(xì)胞的增殖產(chǎn)生危害或誘導(dǎo)不可意料的分化。因此利用此法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為目的細(xì)胞系，必須建立一適宜細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)載體系統(tǒng)。Vallier等24構(gòu)建了一雙順?lè)醋踊蛘T捕載體，該載體可驅(qū)動(dòng)外源基因在體內(nèi)及離體的條件下表達(dá)，

21、且對(duì)導(dǎo)入ES細(xì)胞無(wú)損傷作用。利用此法可獲得高純度的目的細(xì)胞，同樣亦存在目的細(xì)胞的平安性問(wèn)題。2.3細(xì)胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化ES細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境對(duì)ES細(xì)胞分化有很大的影響。為了使ES細(xì)胞維持不分化狀態(tài)，人們選擇在鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ES細(xì)胞;并在培養(yǎng)基中添加LIF。Kaufan等25證明人ES細(xì)胞與鼠骨髓細(xì)胞系S17或卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞系166共培養(yǎng)，可以促進(jìn)人ES細(xì)胞向造血前體細(xì)胞分化。uery等26將人的ES細(xì)胞與鼠血管內(nèi)胚層樣細(xì)胞END-2共培養(yǎng)，在12孔板上大約有3510%的孔出現(xiàn)了搏動(dòng)的區(qū)域，而且誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有正常心肌細(xì)胞的功能。以上三種誘導(dǎo)方法并不是孤立的，它們

22、可以有機(jī)地結(jié)合起來(lái)。Kyba等27證明在ES細(xì)胞中條件表達(dá)Stat5可以誘導(dǎo)造血分化，而將表達(dá)Stat5的EB置于P9基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)，進(jìn)一步增強(qiáng)了造血發(fā)生。這種互相結(jié)合的誘導(dǎo)方法有著廣闊的應(yīng)用前景。3ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化研究存在的問(wèn)題ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化是ES細(xì)胞研究的主要方向，它為今后臨床上進(jìn)展細(xì)胞移植治療提供了充足且良好的細(xì)胞來(lái)源，并且通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)分化的研究可以揭開(kāi)人類自身發(fā)育的神秘面紗;但是迄今為止，仍然未找到可以誘導(dǎo)生成大量較為單一細(xì)胞的方法。細(xì)胞因子誘導(dǎo)方法雖然被廣泛采用，但由于ES細(xì)胞自身也可以分泌一些生長(zhǎng)因子，影響誘導(dǎo)效果，而且細(xì)胞因子方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的特定細(xì)胞數(shù)量較少，純度亦不

23、高，誘導(dǎo)特異性分化后還需要進(jìn)展細(xì)胞篩眩轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)方法研究應(yīng)用時(shí)間較短，在ES細(xì)胞中過(guò)表達(dá)某一誘導(dǎo)分化的基因可以大大進(jìn)步誘導(dǎo)分化的效率，得到純度較高的分化細(xì)胞，然而目的基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻是擺在研究人員面前的一大障礙，而且轉(zhuǎn)染基因容易發(fā)生突變從而影響了整個(gè)ES細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。此外，誘導(dǎo)效率不高，尋找合適的共同培養(yǎng)條件較為困難，使得細(xì)胞共培養(yǎng)方法目前尚未得到廣泛應(yīng)用。還有特定分化細(xì)胞的擴(kuò)增、ES細(xì)胞向有功能器官的分化、分化細(xì)胞應(yīng)用于移植治療的免疫排擠和平安性等問(wèn)題仍未解決。但我們相信，隨著新的發(fā)育相關(guān)基因的不斷被發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化方法的不斷成熟，穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞方法的建立，ES細(xì)胞在組織工

24、程等領(lǐng)域必將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。總的來(lái)說(shuō)，ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化研究是一項(xiàng)探究性很強(qiáng)，具有重大意義的研究課題。我們相信，隨著這些關(guān)鍵性問(wèn)題的解決，ES細(xì)胞定向分化的機(jī)理一定可以說(shuō)明?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1rssA,EnverT.Thelineageitentfhaepietiprgenitrells.urrpinGenetDev,1997,7:609.2NiaH,iyazakiJ,SithAG.Quantitativeexpressinft23/4definesdifferentiatin,dedifferentiatinrself-renealfESells.NatGenet,2000,24:37

25、2-376.3NihlsJ,ZevnikB,AnastassiadisK,etal.FratinfpluriptentsteellsintheaalianebrydependsnthePUtransriptinfatrt-4.ell,1998,95:379-391.4ihaelG,Klun,arkII,etal.Genatiallyseletedardiyytesfrdifferentiatinnebrynisteellsfrstableintraardiagrafts.linInvest,1996,98:216.5Shuldiner,Yanuka,Itskvitz-EldrJ,etal.Ef

26、fetsfEightgrthfatrsnthedifferentiatinfellsderivedfrHuanebrynisteells.Pre.Nail.Aad.Si.USA,2000,97(21):11307.6Strbing,Ahnert-HilgerG,ShanJ,etal.Differentiatinfpluriptentebrynisteellsinttheneurnallineageinvitrgivesrisetatureinhibitryandexitatryneurns.eh.Dev,1995,53:275-287.7Shuldiner,EigesP,EdenA,etal.

27、Induedneurnaldifferentiatinfhuanebrynisteells.BrainRes,2001,913:201-205.8StreitA,BerlinerAJ,Papanaytu,etal.InitiatinfneuralindutinbyFGFsignallingbefregastrulatin.Nature,2000,406(6791):74-78.9ilsnSI,GrazianE,HarlandP,etal.AnearlyrequireentfrFGFsignallingintheaquisitinfneuralellfateinthehikebry.urrBil

28、,2000,10:421-429.10YingQI,Stavridis,GriffithsD,etal.nversinfebrynisteellsintneuretderalpreursrsinadherentnulture.Nat.Biteh,2022,21:183-186.11KraerJ,Hegert,GuanK,etal.EbrynisteellderivedhndrgenidifferentiatininvitrativatinbyBP-2andBP-4.eh.Dev,2000,92(2):193-205.12LiF,LuSJ,VidaL,etal.Bnerphgenetiprtei

29、nindueseffiientheatpietidifferentiatinfrhesusnkeyebrynisteellsinvitr.Bld,2001,98(2):335-342.13hadikK,angLS,LiL,etal.ytkinesandBP-4prteheatpietidifferentiatinfhuanebrynisteells.Bld,2022,102(3):906-915.14XuRH,henX,LiDS,etal.BP-4initiateshuanebrynisteelldifferentiatinttrphblast.NatBiteh,2002,20(12):126

30、1-1264.15DelraP,RnaP,I,etal.Fibrblastgrthfatrreeptr-lisessentialfrinvitrardiyytedevelpent.ir.Res2022,93:414-420.16Shuldine,Yanuka,Itskvitz-EldrJ,etal.Effetsfeightgrthfatrsnthedifferentiatinfellsderivedfrhuanebrynisteells.Pr.Natl.Aad.Si.USA,2000,97(21):11307-11312.17SahinidisA,KlssvE,FleishannBK,etal

31、.Generatinfardiyytesfrebrynisteells.Herz,2002,27:589-597.18Ventura,aili.piidpeptidegeneexpressinpriesardigenesisinebrynalpluriptientsteells.ir.Res,2000,87(3):189-194.19LiH,RblinG,LiuH,etal.Generatinfhairellsbystepisedifferentiatinfebrynisteells.Pr.Nat.IAad.Si.USA,2022,100:13495-13500.20ViariI,ShiangT.TransferfFGF-2viaHSV-1-basedaplinvetrsprteseffiie