常用抗菌藥物的抑殺菌活性檢測(cè)與評(píng)價(jià)課件

1、 微生物學(xué) 綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)常用抗菌藥物的抑殺菌活性檢測(cè)與評(píng)價(jià) 匯報(bào)人：第三組成員名單：目錄CONTENTS實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸韺?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析討論實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力1 鞏固已學(xué)習(xí)的微生物實(shí)驗(yàn)技能，學(xué)以致用2培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)3 培養(yǎng)學(xué)生總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和撰寫(xiě)科研論文的能力4抗生素1 中藥復(fù)方抗菌類(lèi)藥物2實(shí)驗(yàn)原理抗 生 素 抗生素是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）產(chǎn)生、能抑制或殺滅其他微生物的物質(zhì)?？股丶炔粎⑴c細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也不是細(xì)胞內(nèi)的貯存性養(yǎng)料，對(duì)產(chǎn)生菌本身無(wú)害，但對(duì)某些微生物有拮抗作用，是微生物在種間競(jìng)爭(zhēng)中戰(zhàn)勝其他微生物保存自己的一種防衛(wèi)機(jī)制。Firef

2、lySeries實(shí)驗(yàn)原理天然品人工合成品微生物對(duì)天然抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得的部分合成產(chǎn)品抗生素的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理2 抗生素的作用具有選擇性，不同抗生素對(duì)不同病原菌的作用不一樣。對(duì)某種抗生素敏感的病原菌種類(lèi)稱(chēng)為該抗生素的抗生譜（抗菌譜）。 廣譜抗生素對(duì)多種病原菌有抗生作用，例如青霉素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都有良好藥效，鏈霉素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌都有良好藥效，對(duì)結(jié)核桿菌有特殊的療效。 抗生素的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理3 有效作用濃度。各種抗生素一般都在很低濃度下對(duì)病原菌就發(fā)生作用，這是抗生素區(qū)別于其他化學(xué)殺菌劑的又一主要特點(diǎn)。 各種抗生素對(duì)不同微生物的有效濃度各異，通常以抑制微生物生長(zhǎng)的最低濃度作為抗生素的抗

3、菌強(qiáng)度，簡(jiǎn)稱(chēng)有效濃度 。 有效濃度越低，表明抗菌作用越強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)原理抗生素分解或失去活性抗拒藥物的靶點(diǎn)發(fā)生變化細(xì)胞特性的改變細(xì)菌產(chǎn)生藥泵將進(jìn)入細(xì)胞的抗生素泵出細(xì)胞細(xì)菌對(duì)抗生素（包括抗菌藥物）的抗藥性的4種機(jī)制雙黃連一種理想的抗病毒及細(xì)菌感染的中藥新劑型，清熱解毒用于風(fēng)熱感冒發(fā)熱，咳嗽，咽痛實(shí)驗(yàn)原理傳統(tǒng)中藥的抗菌活性（金銀花、黃芩、連翹）清熱解毒口服液感冒類(lèi)非處方藥藥品，清熱解毒用于熱毒壅盛所致發(fā)熱面赤，煩躁口渴，咽喉腫痛等癥；流感、上呼吸道感染等實(shí)驗(yàn)原理傳統(tǒng)中藥的抗菌活性（含有石膏 、知母 、金銀花、 連翹 、黃芩、 梔子、 龍膽、 板藍(lán)根 、 甜地丁、玄參 、地黃 、麥冬）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路明確實(shí)

4、驗(yàn)?zāi)康?、原理?lián)系原有知識(shí)形成各種思路評(píng)價(jià)各種思路選擇最優(yōu)思路確定總方案實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路大腸桿菌、白色葡萄球菌雙黃連、清熱解毒口服液鏈霉素、氨芐青霉素、卡那霉素二倍濃度稀釋法菌種濃度藥品實(shí)驗(yàn)步驟配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基打孔器打出直徑6mm的圓形小濾紙片，約200張；制備生理鹽 水；將 牛津杯、槍頭盒以及上述實(shí)驗(yàn)材料包扎好，于高壓蒸汽滅菌 鍋內(nèi)121 下滅菌0.75mL 0.75mL 0.75mL0.75ml無(wú)菌生理鹽水0.75mL藥品原液（100g/mL）對(duì)三種抗生 素進(jìn)行二倍稀釋?zhuān)渲瞥鰸舛葹?0g/mL，25g/mL，12.5g/mL，6.25g/mL的藥品稀釋液。實(shí)驗(yàn)步驟0.5mL 0.5mL

5、0.5mL 0.5mL4.5ml無(wú)菌生理鹽水0.5mL初配菌懸液菌種的擴(kuò)繁將 6支裝有培養(yǎng)基的已滅菌的試管拉斜面，劃線接種實(shí)驗(yàn)室提供的菌種，進(jìn)行擴(kuò)繁，每個(gè)菌種各3個(gè)斜面，然后恒溫37培養(yǎng)24h。菌懸液的制備試管中的無(wú)菌生理鹽水約10mL，取一半倒入白色葡萄球菌的斜面中，將菌種刮下混勻；試管中剩余的生理鹽水取一半倒入大腸桿菌的斜面中，將菌種刮下混勻。 實(shí)驗(yàn)步驟藥品pH值的調(diào)節(jié)首先，使用pH廣泛試紙大致測(cè)定藥品酸堿度范圍，然后使用精密試紙測(cè)出具體pH值，利用氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液，在原pH值基礎(chǔ)上使藥品偏酸性和偏堿性，并保證新調(diào)節(jié)的pH在兩側(cè)大致對(duì)稱(chēng)。用移液器為每個(gè)平板接種0.2mL稀釋過(guò)的菌懸液

6、，接著用涂布棒小心地將菌液在培養(yǎng)基表面輕輕涂抹均勻。貼平板同時(shí)，取初配的、未經(jīng)過(guò)梯度稀釋的大腸桿菌、白色葡萄球菌的菌懸液各0.2mL涂平板，留作計(jì)算CFU用。實(shí)驗(yàn)步驟 三種抗生素，每種都有五個(gè)濃度，分別為100g/mL，50g/mL，25g/mL，12.5g/mL，6.25g/mL。每個(gè)平板貼6個(gè)濾紙片，分別為同種藥品的五個(gè)濃度，和中間的生理鹽水對(duì)照。對(duì)同一菌種，每種藥物重復(fù)3皿。兩種中藥，無(wú)需稀釋。每個(gè)平板內(nèi)貼5枚濾紙片，分別為2枚清熱解毒口服液，2枚雙黃連口服液，和中間的生理鹽水對(duì)照。每個(gè)菌種重復(fù)2皿。濾紙片法：每張濾紙片吸取20L所需藥品，待完全干燥后貼平板實(shí)驗(yàn)步驟同時(shí)，將各藥物的最高濃

7、度集中到了一個(gè)平板上，以便觀察和分析。平板上共6枚濾紙片，包括了五種藥品和中間的生理鹽水對(duì)照。牛津杯法菌種白色葡萄球菌，藥品鏈霉素。每個(gè)平板放置6個(gè)牛津杯，分別為五個(gè)濃度的鏈霉素，生理鹽水對(duì)照。研究pH值對(duì)藥物抑殺菌效果的影響，選用白色葡萄球菌，分別將偏酸、偏堿、原pH值的藥物注入到牛津杯中，每杯加20L，同時(shí)在中間設(shè)置一個(gè)生理鹽水對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟要注意所有操作保證在無(wú)菌條件下進(jìn)行。培養(yǎng)皿全部按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理完畢后，放在37下培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果、分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步規(guī)劃。 1.1大腸桿菌的菌落數(shù) 表1 大腸桿菌的菌落數(shù) 1.2 白色葡萄球菌的菌落數(shù)表2 白色葡萄球菌的菌落數(shù) 表3 鏈霉素對(duì)大

8、腸桿菌菌的抑菌圈直徑大小表4 卡那霉素對(duì)大腸桿菌菌的抑菌圈直徑大小2.2各種藥品對(duì)大腸桿菌抑菌效果的結(jié)果與分析氨芐青霉素對(duì)大腸桿菌沒(méi)有明顯的抑菌效果分析1.這兩種抗生素對(duì)大腸桿菌都都有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑分布在820mm之間，直徑與藥劑濃度呈正相關(guān)，其中卡那霉素效果較明顯。2.從實(shí)驗(yàn)得出鏈霉素和卡那霉素對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度均為6.25g/mL。表5 清熱解毒液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑大小分析： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙黃連對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑菌效果，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，雙黃連對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)抑菌作用，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。清熱解毒口服液對(duì)大腸桿菌有抑菌效果，但不明顯。就中藥和抗生素對(duì)大腸桿菌的抑菌效果相比，抗

9、生素的抑菌效果較中藥更好一些。2.3各種藥品對(duì)白色葡萄球菌的抑菌圈結(jié)果示意圖鏈霉素氨芐青霉素卡那霉素兩種中藥2.4各種藥品對(duì)白色葡萄球菌抑菌效果的結(jié)果與分析表6 鏈霉素對(duì)白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小表7 卡那霉素對(duì)白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小氨芐青霉素對(duì)白色葡萄球菌沒(méi)有明顯的抑菌效果分析：1.這兩種抗生素對(duì)大腸桿菌都都有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑分布在625mm之間，直徑與藥劑濃度呈正相關(guān)，其中鏈霉素效果較明顯。2.從實(shí)驗(yàn)得出卡那霉素對(duì)白色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為25g/mL，而鏈霉素的最低抑菌濃度在6.25g/mL 12.5g/mL 之間，通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)我們得出鏈霉素的最低抑菌濃度為7.5

10、g/mL 。表7 雙黃連對(duì)白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小分析： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清熱解毒口服液對(duì)白色葡萄球菌沒(méi)有抑菌效果。雙黃連對(duì)白色葡萄球菌有抑菌效果，但不明顯。就中藥和抗生素對(duì)白色葡萄球菌的抑菌效果相比，抗生素的抑菌效果較中藥更好一些。2.5 牛津杯法的結(jié)果表8 鏈霉素對(duì)白色葡萄球菌的抑菌圈大小以鏈霉素對(duì)白色葡萄球菌的作用為例濾紙片法與牛津杯法的比較分析： 從鏈霉素對(duì)白色葡萄球菌抑菌效果來(lái)看，在鏈霉素濃度較高時(shí)，濾紙片法的作用效果較牛津杯法好，在濃度很低時(shí)，牛津杯法的作用效果較濾紙片法好，但總體來(lái)說(shuō)，濾紙片法的效果比牛津杯法好。 pH對(duì)不同菌的抑菌效果表9 卡那霉素的不同pH對(duì)兩種菌的抑菌圈直

11、徑大小分析： 采用牛津杯法，以卡那霉素的不同pH值對(duì)大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌效果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：卡那霉素在不同pH值條件下對(duì)兩種菌的抑菌效果不盡相同,在酸性條件下的抑菌效果整體比堿性條件好，但差別不大。 實(shí)驗(yàn)反思 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是綜合不同平板上抑菌圈的大小，而不同的平板其菌懸液的濃度等因素都是不一樣的，從而造成誤差 濾紙片實(shí)驗(yàn)中，雙黃連對(duì)大腸桿菌的抑菌圈均沒(méi)有測(cè)量出數(shù)據(jù)，原因是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于對(duì)移液槍的錯(cuò)誤使用，使加入到培養(yǎng)基中的菌懸液超出實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的加入的量，在對(duì)涂有大腸桿菌的平板貼濾紙片時(shí)，培養(yǎng)基表面還有大量的菌懸液，造成濾紙片無(wú)法吸收藥品溶液。 接種菌過(guò)多結(jié)果 接種菌不多結(jié)果關(guān)于第一次未找出卡那霉素和鏈霉素的MIC的原因分析： 1、牛津杯法的使用。 2、移液槍的錯(cuò)誤使用或是菌懸液濃度過(guò)大致使培養(yǎng)基上菌臺(tái)太厚而影響抗生素的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)反思實(shí)驗(yàn)反思關(guān)于細(xì)菌的抗性 西藥中氨芐青霉素的抑菌效果最差可能是因?yàn)槿粘Ｉ钪惺褂玫念l率太高而使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生的抗性增強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)總結(jié)1.不同藥劑不同濃度對(duì)不同病原菌效果不同;2.鏈霉素是一種很有效的抑殺菌劑，在很低濃度時(shí)就對(duì)病原菌起到有效作用;3.通過(guò)對(duì)氨芐青霉素用牛津杯法加大劑量后，仍沒(méi)有抑菌圈產(chǎn)生