酶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

1、酶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 概述第二節(jié) 酶的來源和生產(chǎn)第三節(jié) 酶和細(xì)胞的固定化第四節(jié) 酶的應(yīng)用第一節(jié) 概述一、酶的特性酶：有催化能力的蛋白質(zhì)酶促反應(yīng)（酶催化反應(yīng)）1961年按酶所催化的反應(yīng)類型將酶分成6大類： 氧化還原酶類； 轉(zhuǎn)移酶類； 水解酶類； 裂合酶類； 異構(gòu)酶類； 合成酶（或稱連接酶）類。二、酶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究；酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的 應(yīng)用開發(fā)；酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究（包括酶傳感器、反應(yīng)檢測等）；酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶（突變酶）的研究；第二節(jié) 酶的來源和生產(chǎn)利用微生物生產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：一、酶的來源：主要是動植物和微生物微生物具有較強(qiáng)的適

2、應(yīng)性，通過各種遺傳變異的手段， 能培育出新的高產(chǎn)菌株。微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便，并可以通過 控制培養(yǎng)條件來提高酶的產(chǎn)量；微生物種類繁多，動植物體內(nèi)存在的酶，幾乎都 可從微生物中得到；二、酶的生產(chǎn)菌1、對菌種的要求：（4）能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。（3）穩(wěn)定，不易產(chǎn)生變異退化，不易感染噬菌體；（2）不是致病菌；（1）產(chǎn)酶量、酶的性質(zhì)、最好是胞外酶；菌種保藏機(jī)構(gòu)和有關(guān)研究部門，從自然界中分離篩選菌樣采集、菌種分離初篩、純化、復(fù)篩和生產(chǎn)性能鑒定等。改良（如基因突變、基因轉(zhuǎn)移和基因克?。?。2、生產(chǎn)菌的來源：3、目前常用的產(chǎn)酶微生物：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、青霉菌、 木霉菌

3、、根霉菌、鏈霉菌等。三 酶的制備（一） 生物提取蛋白質(zhì)提取，采用保持活性的分離法大致步驟： 細(xì)胞破碎離心分離硫酸銨鹽析透析凝膠過濾離子交換冷凍干燥2、純化倍數(shù)：指提純后與提純前酶比活力 的比值。1、比活力： 單位質(zhì)量酶產(chǎn)品中酶活力稱比活力。比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白（二）利用DNA重組技術(shù)改造和生產(chǎn)酶外源酶基因工程菌重組入優(yōu)點(diǎn)：不受天然來源限制，迅速，且易于誘變改造酶產(chǎn)品酶反應(yīng)幾乎都在水溶液中進(jìn)行，自然簡便缺點(diǎn)是游離酶只能一次性使用，不僅造成酶的浪費(fèi)，而且會增加產(chǎn)品分離的難度和費(fèi)用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量；另外溶液酶很不穩(wěn)定，容易變性和失活。原因：比水溶性酶更適合于多酶反

4、應(yīng)。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：可多次使用，酶的穩(wěn)定性提高。酶與底物和產(chǎn)物易于分開，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少；酶和細(xì)胞的固定化方法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附法共價結(jié)合法離子結(jié)合法吸附法，包埋法，共價鍵結(jié)合法，交聯(lián)法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共價結(jié)合法交聯(lián)法包埋法（1）載體結(jié)合法物理吸附法：載體：無機(jī)載體、天然高分子、大孔型合成樹脂、 疏水型的載體。缺點(diǎn)：酶與載體之間的結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落， 導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。（1）載體結(jié)合法離子結(jié)合法：載體：多糖類離子交換劑和離子交換樹脂，

5、如DEAE-纖維素等。缺點(diǎn)：結(jié)合力也比較弱，酶易脫落 （1）載體結(jié)合法原理：酶分子上的功能團(tuán)，如氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基等和載體表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價鍵，因而將酶固定在載體上。共價結(jié)合法：優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件劇烈，往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的專一性等性質(zhì)也會發(fā)生變化。（2）交聯(lián)法原理：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物 的細(xì)胞與細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法。常用的交聯(lián)劑有戊二醛等。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件強(qiáng)烈，固定化酶的酶活較低；優(yōu)點(diǎn)：酶的穩(wěn)定性提高。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它的二個醛基與酶分子的游離氨基反應(yīng)形成schiff堿，彼此交聯(lián)： CH=N-酶

6、-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-交聯(lián)方式NCH(CH2)3CHNNCH(CH2)3CHNCH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶-N=CH-交聯(lián)法常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。如先使用明膠（蛋白質(zhì)）包埋，再用戊二醛交聯(lián)；常在被交聯(lián)的酶溶液中添加一定量的輔助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的穩(wěn)定性。（3）包埋法網(wǎng)格型、微囊型網(wǎng)格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子和淀粉、明膠、膠原、海藻膠和角叉菜膠等天然高分子。網(wǎng)格型包埋法是固定化細(xì)胞中用得最多、最有效的方法。2、固定化酶的性質(zhì)一般酶活力下降，可在固定化反應(yīng)體系中加入 抑制劑、底物或產(chǎn)物以保護(hù)酶的活性中心。（1）酶活力的變化（2）酶穩(wěn)定性的變化操作穩(wěn)定性，半衰期在1個月以上，可以認(rèn)為 其具有一定的工業(yè)應(yīng)用價值；貯藏穩(wěn)定性；對蛋白酶的穩(wěn)定性。 熱穩(wěn)定性（3）酶學(xué)特性的變化底物專一性、最適pH、最適溫度、米氏常數(shù)最大反應(yīng)速度等，均可能發(fā)生變化。填充床反應(yīng)器第五節(jié) 酶在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用一、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸技術(shù)路線E.coli 斜面固定化細(xì)胞（顆粒狀）青霉素G轉(zhuǎn)化液濾液細(xì)胞6-APA培養(yǎng)明膠包埋-戊二醛交聯(lián)過濾抽提填充床式反