農(nóng)藥登記毒理學(xué)急性吸入毒性試驗(yàn)

1、農(nóng)藥登記毒理學(xué)急性吸入毒性試驗(yàn)1范圍GB/T 15670的本部分規(guī)定了急性吸入毒性試驗(yàn)的基本原則、方法和要求。 本部分適用于為農(nóng)藥登記而進(jìn)行的急性吸入毒性試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施農(nóng)藥登記資料規(guī)定中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部令第10號(hào)（2007年12月8日）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1急性吸入毒性 acute inhalation toxicity實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)（指24 h或24 h之內(nèi)，通常采

2、用4 h）一次連續(xù)吸入較高濃度的受試物（氣體、 蒸汽、氣溶膠或顆粒狀物）出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2吸入劑量inhaled dose動(dòng)物單位體重所吸入受試物的量，即：（1）D二叫a（1）式中：Dih一吸入劑量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c吸入氣中受試物的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；t吸入持續(xù)時(shí)間，單位為分（min）；R呼吸頻率，單位為次每分（次/min）；Tv受試動(dòng)物的潮氣量，單位為升每次（L/次）；a一與受試物反應(yīng)性和溶解性相關(guān)的保持系數(shù)；W一體重，單位為千克（kg）。3.3半數(shù)致死濃度 median lethal concentration（LC50）在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，經(jīng)呼吸道一次

3、連續(xù)吸入受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué) 濃度，以單位體積空氣中受試物的質(zhì)量（mg/m3）來表示。3.4劑量-反應(yīng)關(guān)系 dose-response relationship劑量與特定效應(yīng)的發(fā)生率間的關(guān)系。3.5空氣動(dòng)力學(xué)直徑 aerodynamic equivalent diameter, AD將不同形狀和密度的氣溶膠顆粒與不同直徑的標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0 g/cm3）球形顆粒相對(duì)比，當(dāng)它們 的終端沉降速度相同時(shí)，就以該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑表示此氣溶膠顆粒的直徑，并稱之為該氣溶膠顆粒 的空氣動(dòng)力學(xué)直徑，其計(jì)量單位為微米3m）。3.6質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑 mass median

4、aerodynamic diameter, MMAD由空氣動(dòng)力學(xué)直徑大小不一的顆粒組成的氣溶膠樣品中，小于和等于某一空氣動(dòng)力學(xué)直徑（例如5 |im）的顆粒占?xì)馊苣z樣品總質(zhì)量或總重量50%時(shí)，則該氣溶膠顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)直徑即為此氣溶膠樣品 的質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑（5 gm）o3.7幾何標(biāo)準(zhǔn)差 geometric standard deviation, GSD用以描述氣溶膠顆粒粒徑范圍的無量綱數(shù)。幾何標(biāo)準(zhǔn)差越小，含相似大小的顆粒比例越高，亦即氣 溶膠顆粒的均一性越好，離散度越低。通常，將幾何標(biāo)準(zhǔn)差小于或等于2的氣溶膠樣品稱為單相分散氣 溶膠。3.8可吸入顆粒直徑inhalable diameter

5、能夠通過研究對(duì)象的口和/或鼻吸入并沉淀在呼吸道任意部位的顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑。通常將空 氣動(dòng)力學(xué)直徑在10 |im以下的氣溶膠顆粒物稱為可吸入顆粒物。4試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^短時(shí)間吸入染毒可初步了解受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性毒性特征和劑量-反應(yīng)關(guān)系，為急性吸入 毒性分級(jí)、標(biāo)簽管理和其他有關(guān)的毒理學(xué)研究提供科學(xué)的參考資料，也能夠?yàn)橹贫ㄉa(chǎn)和應(yīng)用過程中的 防護(hù)措施提供依據(jù)。5試驗(yàn)概述根據(jù)受試物的理化性質(zhì)，選擇適宜的方法，將其制備成特定濃度的氣態(tài)、蒸汽態(tài)、氣溶膠態(tài)或者顆 粒狀物混懸態(tài)，輸入至動(dòng)式染毒系統(tǒng)；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照及不同染毒劑量組，分別放置于染毒系 統(tǒng)中進(jìn)行4 h的暴露，染毒結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移出；仔細(xì)

6、觀察染毒期間及14 d內(nèi)的毒性作用表現(xiàn)和體征、 死亡等情況，死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖；觀察期終了時(shí)，處死動(dòng)物做大體解剖，如發(fā)現(xiàn)病變組織或 器官應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。6試驗(yàn)方法試驗(yàn)準(zhǔn)備受試物受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，注明名稱、來源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、 保存條件及配制方法等，并附有檢驗(yàn)報(bào)告。所用賦形劑、溶劑或其他介質(zhì)等均應(yīng)標(biāo)明批號(hào)、規(guī)格和生產(chǎn) 廠家。受試物氣化或氣溶膠制備方法選擇與準(zhǔn)備氣態(tài)受試物經(jīng)流量計(jì)與空氣混合成一定濃度之后，直接輸入染毒柜。沸點(diǎn)較低易揮發(fā)的液態(tài)受試物通過空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使其揮發(fā)后，再與空氣混合，通入染毒柜中。高沸點(diǎn)不易揮發(fā)液態(tài)受試物根據(jù)受試物的

7、理化特性，可以選取噴霧方法，或者利用氣溶膠發(fā)生裝置，制備符合試驗(yàn)要求的液態(tài) 氣溶膠再與一定量的空氣混合輸入至染毒柜中。粉狀或固體受試物利用氣溶膠發(fā)生裝置，將受試物制備成固體氣溶膠，再與一定量的空氣混合，通入染毒柜中。動(dòng)式吸入染毒方法采用機(jī)械通風(fēng)裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度受試物的空氣均勻地送入染毒柜，換氣量大約為12 次/h15次/h,維持相對(duì)穩(wěn)定的染毒濃度。采用全身暴露或頭/鼻部暴露方式對(duì)動(dòng)物進(jìn)行持續(xù)4 h的急性 吸入性染毒。染毒時(shí)，染毒柜內(nèi)染毒氣體的分配保持均衡，氧含量不低于9%, CO2含量不高于1%，溫 度在（223）,相對(duì)濕度30%70% （特殊情況，如蒸汽態(tài)染毒除外）。如果采用動(dòng)

8、物全身暴露的染 毒方式，為確保染毒柜內(nèi)空氣穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)注意使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總體積不超過染毒柜體積的5%。染毒柜內(nèi) 應(yīng)維持微弱的負(fù)壓，以防受試物泄漏污染周圍環(huán)境。同時(shí)，應(yīng)注意防止受試物爆炸。染毒系統(tǒng)可靠性的確定吸入毒性試驗(yàn)中，應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的氣態(tài)、蒸汽態(tài)或氣溶膠狀態(tài)的受試物。其濃度應(yīng)通過間斷（至 少每30 min采樣一次）或連續(xù)采樣，并通過適當(dāng)?shù)姆治鰞x器，采用可靠的檢測(cè)方法進(jìn)行監(jiān)控。對(duì)于以氣溶膠染毒方式進(jìn)行的吸入毒性試驗(yàn)，除了分析染毒柜中的濃度之外，還應(yīng)測(cè)定氣溶膠顆粒 的大小及其分散度。在對(duì)染毒柜濃度進(jìn)行的動(dòng)態(tài)檢測(cè)過程中，如果連續(xù)兩次測(cè)定的結(jié)果能夠證明染毒柜內(nèi)受試物的濃度 相對(duì)恒定，液態(tài)或氣態(tài)農(nóng)藥及其

9、制劑在設(shè)定吸入濃度的10%,固態(tài)或干粉制劑制備的氣溶膠在擬采用 吸入濃度20%的范圍之內(nèi)波動(dòng)，則認(rèn)為染毒系統(tǒng)對(duì)濃度的平衡和控制是成功的。否則，需要繼續(xù)進(jìn)行 調(diào)試。如果是固態(tài)或干粉制劑制備的氣溶膠，還需對(duì)其粒徑進(jìn)行連續(xù)測(cè)定和監(jiān)控。通常要求所制備氣溶 膠的MMAD值在1 gm4 gm范圍內(nèi)，且應(yīng)達(dá)到連續(xù)兩次測(cè)定的MMAD值的波動(dòng)范圍在10%之內(nèi)，GSD 在1.53.0之間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選健康8周10周大鼠，體重差異不得超過同性別平均體重的20%。選用其他動(dòng)物需說明適當(dāng)?shù)?理由。應(yīng)使用具有質(zhì)量合格證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。飼養(yǎng)條件正式試驗(yàn)之前，動(dòng)物應(yīng)在試驗(yàn)環(huán)境中檢疫、適應(yīng)3 d5 d時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼

10、養(yǎng)條件應(yīng)符合GB 14925的有關(guān)規(guī)定。每個(gè)濃度組的動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠動(dòng)物數(shù) 量以不干擾動(dòng)物個(gè)體活動(dòng)及觀察反應(yīng)為度。動(dòng)物食用常規(guī)飼料，自由飲水。數(shù)量和性別每個(gè)濃度組至少10只動(dòng)物，雌雄各5只。雌性動(dòng)物應(yīng)為未妊娠和未經(jīng)產(chǎn)的。吸入劑量與分組至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)不同濃度的染毒組，組間濃度距離適當(dāng)，以便能夠在各濃度組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中發(fā)生一 定程度的毒效應(yīng)和死亡。同時(shí)，設(shè)空白和/或相應(yīng)賦型劑、溶劑或其他介質(zhì)對(duì)照組，所得資料應(yīng)足以繪 制出濃度死亡曲線，并求出lc50直。如果受試物的毒性很低，也可以采用20只大鼠（雌、雄各半），進(jìn)行單一劑量的急性吸入毒性試驗(yàn)。 單一急性吸入染毒濃度應(yīng)為體積分?jǐn)?shù)2X10-2（氣體

11、受試物）、20 mg/L （液體受試物蒸汽）、5 mg/L （固 體或液體受試物氣溶膠），如果因受試物理化性質(zhì)所限，不能達(dá)到該濃度要求，也應(yīng)以受試物所能達(dá)到 的最高濃度進(jìn)行試驗(yàn)。受試物具有爆炸性時(shí)，應(yīng)注意避免采用可能造成爆炸的濃度。試驗(yàn)步驟吸入染毒的實(shí)施染毒濃度的平衡與控制采用試驗(yàn)準(zhǔn)備階段的各種適宜條件，對(duì)染毒濃度、可吸入顆粒直徑等進(jìn)行控制。染毒動(dòng)物的體重測(cè)定與染毒期間的觀察試驗(yàn)開始前，應(yīng)對(duì)每只動(dòng)物的體重進(jìn)行稱量。動(dòng)物持續(xù)吸入受試物的時(shí)間為4 h,染毒過程當(dāng)中，動(dòng)物通常處于禁食和禁水狀態(tài)。吸入染毒期間，應(yīng)注意觀察受試物對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響，如呼吸道刺激反應(yīng)，呼吸節(jié)律的變化，以及 吸氣和呼氣模式的改

12、變等。試驗(yàn)觀察和檢查觀察期限吸入染毒結(jié)束之后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天至少仔細(xì)觀察1次，連續(xù)14 d。但觀察期也不是固定不變，可依 據(jù)毒性反應(yīng)和體征的發(fā)生時(shí)間，以及恢復(fù)期的長(zhǎng)短進(jìn)行調(diào)整。如果染毒后動(dòng)物出現(xiàn)中毒反應(yīng)、死亡時(shí)間 延遲，觀察期限應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)，最長(zhǎng)不超過21 do觀察內(nèi)容詳細(xì)觀察并記錄染毒動(dòng)物的臨床表現(xiàn)和體征，包括出現(xiàn)時(shí)間及其恢復(fù)時(shí)間、動(dòng)物死亡時(shí)間等。觀察 的內(nèi)容包括：a）中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)：體位異常、叫聲異常、不安、呆滯、震顫、抽搐、麻痹、運(yùn)動(dòng) 失調(diào)、對(duì)外反應(yīng)過敏或遲鈍，異常行為如過度反復(fù)抓撓口周、梳理、轉(zhuǎn)圈，甚至自殘、倒退行 走等；b）植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔擴(kuò)大或縮小、流涎或流淚；c）呼吸系

13、統(tǒng)：鼻孔流液、鼻衄、鼻翼扇動(dòng)、呼吸深緩、呼吸過速、蜂腰；d）泌尿生殖系統(tǒng)：會(huì)陰部污穢、有分泌物、陰道腫脹；e）皮膚和被毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松或潮濕、污穢；f）眼：眼球突出、結(jié)膜充血、溢血性分泌物、角膜混濁；g）消化系統(tǒng)：腹瀉、厭食。記錄中毒體征的出現(xiàn)和消失時(shí)間以及動(dòng)物死亡時(shí)間，特別是有死亡延遲趨勢(shì)時(shí)，更應(yīng)認(rèn)真觀察和記 錄。衰弱或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)迅速隔離，人道處死并解剖檢查，按中毒死亡處理。觀察期間如果發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡 應(yīng)及時(shí)解剖，如不能立即檢查，應(yīng)冷藏保存，并在24 h內(nèi)進(jìn)行解剖檢查。體重稱量應(yīng)分別在染毒前、染毒后（至少每周一次）和動(dòng)物處死之前稱量并詳細(xì)記錄體重。病理學(xué)檢查所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行大

14、體解剖，包括試驗(yàn)過程中死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動(dòng)物。應(yīng) 特別注意呼吸系統(tǒng)的任何改變，對(duì)于任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，均應(yīng)記錄并進(jìn)行組 織病理學(xué)檢查。其他指標(biāo)檢查必要時(shí)，根據(jù)受試物的性質(zhì)及所觀察的毒性反應(yīng)，宜增加其他敏感指標(biāo)的檢查。7試驗(yàn)結(jié)果和評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）用表格列出試驗(yàn)中獲得的各染毒組及對(duì)照組兩種性別動(dòng)物的全部原始數(shù)據(jù)，具體內(nèi)容包括動(dòng)物 編號(hào)、性別、染毒劑量、體重、各種體征及程度、死亡或存活情況、大體解剖及組織病理學(xué)檢 查結(jié)果；b）分別統(tǒng)計(jì)各組及不同性別動(dòng)物的數(shù)目，體征發(fā)生、死亡、存活、大體解剖及組織病理學(xué)檢查的 各類病變發(fā)生的頻數(shù);計(jì)算不同組、

15、不同性別動(dòng)物上述各項(xiàng)的發(fā)生率及不同時(shí)間的體重平均值；c）空氣中受試物濃度、粒徑、分散度等的測(cè)定結(jié)果；d）染毒空氣的溫度、相對(duì)濕度檢測(cè)結(jié)果；e）用適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；f）可能的情況下，計(jì)算出劑量-效應(yīng)或劑量-反應(yīng)關(guān)系；g）計(jì)算吸入染毒的lc50值。試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時(shí)間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室的歷史 背景數(shù)據(jù)、組織病理學(xué)檢查的結(jié)果以及同類受試物的毒理學(xué)資料等，對(duì)受試物經(jīng)呼吸道吸入染毒的毒理 學(xué)作用特點(diǎn)做出初步評(píng)價(jià)；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判 斷毒性作用靶器官；如果能夠得出比較明確的劑量-

16、效應(yīng)、劑量-反應(yīng)曲線，可以對(duì)受試物經(jīng)呼吸道吸入 染毒作用的閾值做出初步評(píng)價(jià)；求出lc50值，對(duì)受試物的急性吸入毒性級(jí)別做出評(píng)價(jià)，急性吸入毒性級(jí) 別按照農(nóng)藥登記資料規(guī)定3.3.2.8條的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定；總結(jié)受試物的安全范圍、出現(xiàn)毒性的嚴(yán)重程度 及可恢復(fù)性。急性吸入毒性試驗(yàn)的結(jié)果可為相關(guān)的后續(xù)毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的選擇提供參考，也可提示一些后續(xù)毒性 試驗(yàn)需要重點(diǎn)觀察的指標(biāo)。在參考或引用這些試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意各種數(shù)據(jù)和資料之間的有機(jī)聯(lián)系。 lc50值應(yīng)當(dāng)被看作一個(gè)相對(duì)粗糙的毒理學(xué)指標(biāo)，主要用于標(biāo)識(shí)某一受試物吸入毒性效能及作為對(duì)其進(jìn)行 毒性分級(jí)的依據(jù)，在引用或參考lc50值時(shí)，除了應(yīng)結(jié)合受試物的毒性效應(yīng)、組織

17、病理學(xué)檢查等結(jié)果之外， 還應(yīng)始終注意動(dòng)物的種屬、染毒時(shí)間的長(zhǎng)短和計(jì)算lc50的方法等具體問題。8試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報(bào)告編號(hào)；b）試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期和封樣情況；c）試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期；d）試驗(yàn)摘要；e）受試物名稱、有效成分美國(guó)化學(xué)文摘登錄號(hào)（CAS號(hào)）（如已知）、代碼（如有）、純度（或 含量）、劑型、生產(chǎn)日期（批號(hào)）、理化性質(zhì)、配制所用溶劑和方法；f）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、級(jí)別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)），檢疫、適應(yīng)情況，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，包括溫度、相對(duì)濕度、飼料、 單籠飼養(yǎng)或群飼