基因功能研究常用方法

1、關(guān)于基因功能研究常用方法第1頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 弄清基因的生物學(xué)功能,才能明確基因在疾病發(fā)生中的具體作用、弄清疾病發(fā)生的分子機(jī)制。常用的基因功能研究技術(shù)包括：（1）DNA克隆技術(shù)（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)和核轉(zhuǎn)移技術(shù)（動(dòng)物克隆）（3）基因敲除技術(shù)（4）反義技術(shù)（5）RNA干涉技術(shù)第2頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 第一節(jié) DNA克隆技術(shù)第3頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 克隆(clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。（一） DNA克隆第4頁(yè)，共66

2、頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四技術(shù)水平：分子克隆 即DNA 克隆 細(xì)胞克隆個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）第5頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。 也稱(chēng)基因克隆或重組DNA 。 第6頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的 分離獲得某一

3、感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，又稱(chēng)重組DNA工藝學(xué)。第7頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶第8頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四重組DNA技術(shù)中常用的工具酶第9頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（三）目的基因 cDNA基因組DNA目的基因 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表

4、達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）第10頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第11頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為表達(dá)載體。第12頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)

5、記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。第13頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 第14頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?. 噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第15頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5

6、月20日，5點(diǎn)52分，星期四3. 粘性質(zhì)粒(cosmid)第16頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第17頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四二、重組DNA技術(shù)基本原理克隆基本過(guò)程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 第18頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月2

7、0日，5點(diǎn)52分，星期四 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過(guò) 程目 錄第19頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(kù)(genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù)(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見(jiàn)第22章） 第20頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建若將外源基因連接到復(fù)制子(基因載體)上,外源DNA就可以作為復(fù)制子的一部

8、分在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制.在基因克隆中基因載體的選擇與構(gòu)建是一項(xiàng)技術(shù)性很強(qiáng)的工作,直接影響到基因克隆的成敗.第21頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接第22頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌K-12改造）限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 感染（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌第23頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(

9、2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等第24頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目 錄第25頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核轉(zhuǎn)移技術(shù)第26頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)

10、移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)第27頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第28頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 轉(zhuǎn)基因生物是指用實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整和并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。自從1982年P(guān)almiter等首次將大鼠生長(zhǎng)激素基因?qū)诵∈笫芫研坌栽酥?，獲得了個(gè)體比對(duì)照組大一倍的轉(zhuǎn)基因“超級(jí)小鼠”以來(lái)，這項(xiàng)高新技術(shù)受到各國(guó)重視，發(fā)展迅速，取得不少突破，全世界已申請(qǐng)的工

11、程動(dòng)物專(zhuān)利達(dá)到80多項(xiàng)。第29頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物整體水平研究目的基因的生物技術(shù)，特點(diǎn)是“分子及其細(xì)胞水平的操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”第30頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過(guò)程轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮中對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行鑒定第31頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法DNA顯微注射法克隆法胚胎干細(xì)胞技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移精子載體法等各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，常用的是顯微注射和克隆法第32頁(yè)，共66

12、頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定Southern雜交 確定外源基因的整合以及整合的拷貝數(shù)RT-PCR 確定外源基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄水平Western雜交 確定外源基因蛋白質(zhì)的表達(dá)情況實(shí)時(shí)PCR（熒光定量PCR）第33頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用（1）建立致病基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型（2）動(dòng)植物新品種的培育（3）各種基因工程產(chǎn)品的制備（4）探討生殖細(xì)胞的基因治療方法第34頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 囊性纖維變性是一種遺傳病，患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的內(nèi)部通道，大約有一

13、半的患者活不過(guò)31歲。英國(guó)PPT公司培育了植入人體基因的克隆羊，羊奶中含有能夠治療囊性纖維變性的人體蛋白。 維爾莫特所在的研究所曾向德國(guó)一家藥廠(chǎng)出售一頭這樣的轉(zhuǎn)基因羊，獲得50萬(wàn)英鎊。第35頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)。這樣的個(gè)體所攜帶的性狀僅來(lái)自一個(gè)父親或母親個(gè)體,為無(wú)性繁殖.1996年,克隆羊”多莉”的產(chǎn)生成為當(dāng)年分子生物學(xué)發(fā)展最重要的事件二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)第36頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 克隆羊“多利”第37頁(yè)，共66

14、頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第38頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四基因剔除技術(shù)也稱(chēng)基因靶向(gene targeting)滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。第三節(jié)、基因剔除技術(shù)第39頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 基因剔除程序?qū)缁畹幕蚍湃肱咛ジ杉?xì)胞(ES細(xì)胞),使這一滅活的基因通過(guò)同源重組取代原有目的基因,篩選到基因定點(diǎn)滅活的細(xì)胞后,通過(guò)顯微注射到小鼠囊胚.細(xì)胞在小鼠囊胚參與胚胎的發(fā)育,最終形成嵌合體小鼠,由于一部分生殖細(xì)胞來(lái)源于ES細(xì)胞,通過(guò)小鼠培養(yǎng)可獲得純合子基因剔除小鼠.第40頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20

15、日，5點(diǎn)52分，星期四 基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物疾病可遺傳的模型,探討疾病發(fā)生機(jī)制 單基因決定疾病模型 進(jìn)行基因剔除以模擬基因失活.單基因疾病模型:地中海貧血,動(dòng)脈硬化,老年癡呆等 多基因決定疾病模型 多基因疾病模型:腫瘤,高血壓,糖尿病第41頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 第四節(jié) 基因沉默技術(shù)第42頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四基因沉默技術(shù)反義(antisen)技術(shù)RNA干涉(RNA Interference,RNAi)第43頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四反義技術(shù)反義RNA是根據(jù)RNA序列合成的

16、互補(bǔ)RNA,可分為三類(lèi):作用于核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA形成雙鏈;作用于非編碼區(qū);作用于啟動(dòng)子反義DNA在DNA或RNA水平上以至轉(zhuǎn)錄與翻譯,其穩(wěn)定性好,有廣泛藥用價(jià)值核酶是具有酶活性的RNA,參與RNA加工與成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表達(dá)第44頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四RNA干涉(RNAi)RNA干涉技術(shù)是利用體外合成的短雙鏈RNA(21-23nt) 抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù),是轉(zhuǎn)錄后基因失活的一種研究基因功能的有力工具機(jī)制:第45頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四RNAi技術(shù)DicerRNAi技術(shù)第46頁(yè)，共66頁(yè)，20

17、22年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四siRNA5353第47頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRP第48頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四Effector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activation第49頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四RNAi技術(shù)第50頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)課程作業(yè)根據(jù)自身專(zhuān)業(yè)和研究方向，以RNAi技術(shù)在

18、XXX領(lǐng)域的研究進(jìn)展為題目，寫(xiě)一篇小綜述。寫(xiě)作要求：1. 按照一般發(fā)表文獻(xiàn)的格式書(shū)寫(xiě)。2. 可查閱CNKI（中國(guó)知網(wǎng)）或Pubmed上相關(guān)文獻(xiàn)，不得抄襲！3. 字?jǐn)?shù)：3000字左右。4. 不得抄襲！第51頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四論文格式題目摘要（Abstract) 200字以?xún)?nèi)正文前言正文問(wèn)題與展望參考文獻(xiàn) 10-15篇第52頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四完成方式：手寫(xiě)稿或電子打印稿完成日期：2012年12月15日前交到醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)樓B-312或者下周上課課堂上交。第53頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四疾病相關(guān)基因的

19、克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第 五 節(jié)第54頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate gene approaches )第55頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52

20、分，星期四定義 從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。第56頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四克隆方式 利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫(kù)。第57頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫(kù)的篩

21、選與基因克隆第58頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四基因定位的基本方法1.體細(xì)胞雜交法 p2832.原位雜交和熒光原位雜交3.連鎖分析第59頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四體細(xì)胞雜交:細(xì)胞雜交又稱(chēng)細(xì)胞融合,是將來(lái)源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞(雜種細(xì)胞).大多數(shù)細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠的體細(xì)胞雜交,它的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中保留小鼠染色體而人染色體逐漸丟失僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的細(xì)胞正是進(jìn)行基因連鎖分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色體上,就可找到某一基因座位第60頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四原位雜交和熒光原位雜交(FISH):根據(jù)疾病基因所編碼蛋白質(zhì)的信息,將其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為探針從基因組DNA中釣取該蛋白質(zhì)量的編碼基因如:用及珠蛋白基因的cDNA作探針,與各種不同的人/鼠雜種細(xì)胞進(jìn)行原位雜交,找出cDNA探針與人染色體DNA的同源互補(bǔ)關(guān)系,從而將及珠蛋白基因分別定位于第16號(hào)和第11號(hào)染色體上.第61頁(yè)，共66頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四連鎖分析原