基因轉(zhuǎn)移和重組體篩選和鑒定

1、關(guān)于基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定第1頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起單酶切、雙酶切第一節(jié) DNA的體外重組DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱(chēng)為重組DNA。第2頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四（一） 直接連接T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 二、平末端（blunt end）的連接第3頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月

2、20日，6點(diǎn)2分，星期四（1）同聚加尾法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。 原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。 加尾堿基互補(bǔ)第4頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來(lái)操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達(dá)。非酶切位點(diǎn)第5頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGE

3、coR I linker：（二） 人工加尾形成 “粘性末端” 第6頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四（1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性?xún)?nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接第7頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （3）DNA接頭 （adapter）連接法 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 第8

4、頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接 優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。 缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。 防止自我連接5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-p5 第9頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口nick缺口

5、HO-OHCIP處理T4 ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5磷酸化第10頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3端1520bp與模板互補(bǔ)； 5端內(nèi)切酶識(shí)別序列保護(hù)堿基避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第11頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物5-3 CCTAGGCGC PCR產(chǎn)物-5 3-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位點(diǎn)BamH I位

6、點(diǎn)AATTC PCR產(chǎn)物5-3 CCTAG PCR產(chǎn)物-5 3-GGEcoR IBamH I兩頭各有一個(gè)粘性末端！第12頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA三、PCR產(chǎn)物的連接2. 與T載體直接連接第13頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（transformation）大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)

7、入細(xì)菌的過(guò)程。第14頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞第15頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四1. 利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化 酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：將兩個(gè)以上的基因同時(shí)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1%2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%33%第16頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四 酵母0.1mol/L L

8、iCl處理感受態(tài)2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40% PEG 4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子 吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個(gè) / g DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少第17頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四4. 電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細(xì)胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個(gè) / g DNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈單鏈含有酵母復(fù)制子可轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制，無(wú)復(fù)制子可同源整合到受體菌染色體上缺點(diǎn)：需要特定儀器，成本較高3. PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細(xì)胞，可獲得類(lèi)感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化第18頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日

9、，6點(diǎn)2分，星期四二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞第19頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌通過(guò)農(nóng)桿菌侵染植物外植體將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細(xì)胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株第20頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤(pán)法的具體操作 第21

10、頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四又稱(chēng)生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2m鎢彈頭 吸附金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞基因槍裝入2. 基因槍法（gene gun） 外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇第22頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四第23頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四具體操作 1. DNA微彈的制備2. 外植體的制備3. DNA微彈轟擊4. 外植體的培養(yǎng)第24頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)2分，星期四植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3. 電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)第25頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5