南農(nóng)生物分離工程生物分離1細胞破碎課件

1、 Cell Membranes 細胞膜 Summary 概述 Chemical Methods 機械破碎 mechanical disruption 非機械破碎細胞破碎技術 Cell Membranes 細胞膜 概述有些目標產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)不會被分泌到發(fā)酵液中，而是在細胞內(nèi)沉積，使胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來一般需要破碎細胞壁 。概述有些目標產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中。尤其是由分 類 機械法非機械法固體剪切法(珠磨法)酶溶法液體剪切法化學降解法（酸堿法）撞擊法表面活性劑法超聲法干燥法滲透法凍融法分 類 機械法非機械法固體剪切法(珠磨法)酶

2、溶法液體剪切本節(jié)主要研究的是革蘭氏陰性原核生物。其細胞結(jié)構(gòu)中沒有細胞核：基因物質(zhì)位于單鏈DNA上。典型的生物是大腸桿菌，是生物技術研究的主體。通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物。細胞膜本節(jié)主要研究的是革蘭氏陰性原核生物。細胞膜Gram-negative procaryotes革蘭氏陰性原核生物（E.coli）Gram-negative procaryotes革蘭氏陰性細胞結(jié)構(gòu)有三層：最外層約8mm厚，酶大多數(shù)鑲嵌在這層膜上。革蘭氏陽性原核生物缺少最外層結(jié)構(gòu)，但有第二層肽聚糖層和胞漿空間。第三層為漿膜層或內(nèi)膜層，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性都有這一結(jié)構(gòu)，該層主要由磷脂組成，還有分散的蛋白質(zhì)分子和金

3、屬離子。 革蘭氏陰性細胞結(jié)構(gòu)有三層：最外層約8mm厚，酶大多數(shù)鑲嵌在這這三層有不同功能。外層及肽聚糖層使細胞有一定的機械強度；破壞該層是本章討論的重點。漿膜層和細胞內(nèi)膜控制細胞的滲透壓，即將營養(yǎng)物質(zhì)運送到細胞內(nèi)，將代謝物排出胞外。這三層有不同功能。外層及肽聚糖層使細胞有一定的機械強度；破壞真核細胞，具有真正的細胞核，其結(jié)構(gòu)要比原核生物復雜的多，以圖所示的酵母菌為例，和原核細胞一樣，真核細胞也具有一層細胞膜。真核細胞，具有真正的細胞核，其結(jié)構(gòu)要比原核生物復雜的多，以圖動物細胞動物細胞植物細胞模式圖植物細胞模式圖 破壁難易程度 與壁強度、壁厚度、聚合物的種類、 細胞的形狀和大小有關 細菌比真菌易破

4、碎 G+用溶菌酶 G-添加EDTA，除去Ca2+ 破壁難易程度細胞破碎理論 1)、細胞破碎A 壓撞 B 剪切 C滲透 凍脹 D 破壁破膜2)、產(chǎn)物釋放細胞破碎理論 1)、細胞破碎方法技術原理效果成本舉例機械法勻漿法（片型）細胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細胞研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理一、機械法方法技術原理效果成本舉例機械法勻漿法（片型）細胞被攪拌器劈碎高速珠磨機珠直徑

5、、數(shù)量、懸浮液濃度、攪拌速度珠磨法高速珠磨機珠磨法WSK臥式高效全能珠磨機Crushing in ball mill 珠磨法 WSK臥式高效全能珠磨機Crushing in ball mZM系列臥式密閉珠(砂)磨機ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機高壓勻漿器高壓勻漿器影響因素操作壓力p：p, R 。溫度 2C /10MPa 。破碎次數(shù)N：N，R 。溫度：比速度k與溫度有關，溫度25C，k1.5倍。細胞種類：如大腸桿菌比酵母易破碎影響因素超聲波破碎(1525kHz)機理在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。發(fā)聲器和換能器 高頻電流 機械振動 功

6、率、工作時間（9S）、間歇時間、工作次數(shù)、 產(chǎn)熱大、實驗室超聲波破碎(1525kHz) Ultrasonication 超聲波超聲波破碎儀 Ultrasonication 超聲波超聲波破碎儀 超聲破碎法超聲破碎法超聲破碎法優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎缺點：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫； D、不易放大，僅應用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。超聲破碎法優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎JJ-2組織搗碎勻漿機JJ-2組織搗碎勻漿機研缽研缽機械法優(yōu)點A、在大規(guī)模cell破碎中，高壓勻漿機和珠磨機用得最多;B、高壓勻漿機最適合于酵母和細

7、菌;C、珠磨機可用于酵母和細菌，但對真菌菌絲和藻類更合適.機械法二、非機械法 二、非機械法方法技術原理效果成本舉例化學法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜血紅細胞的破壞酶消化法細胞壁被消化，使細胞破碎溫和昂貴增溶法表面活性劑溶解細胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機溶劑溶解細胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細胞堿處理法堿的皂化作用使細胞壁融解劇烈便宜化學法方法技術原理效果成本舉例化學法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜Osmotic Shock(滲透沖擊法) 最簡單的是滲透沖擊法。 此法將一定體積的細胞液加到2倍體積的水中，細胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進入細胞，使細胞膨脹，最后導致破裂，釋放胞內(nèi)物。

8、Osmotic Shock(滲透沖擊法) 細胞破碎的難易決定于其類型，紅血球細胞容易溶破，動物細胞只有當其組織被機械切碎或勻漿后才易溶破。植物細胞很難溶破，因為植物細胞中含有大量的木質(zhì)成分，通過滲透流很難滲透。細胞破碎的難易決定于其類型，紅血球細胞容易溶破，動物細胞只有滲透流的動力來自滲透壓，滲透壓可以通過化學平衡來估算： P=RTC 該式稱為范特苛夫定律。許多細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度大約為0.1M NaCl 或0.2M溶質(zhì) 。滲透流的動力來自滲透壓，滲透壓可以通過化學平衡來估算： 例：一種耐鹽細胞其能積累細胞內(nèi)低分子量鹵化物，適應高滲透壓，能在含有0.32mol/LNaCl, 0.02mol/LMgC

9、l2 , 0.015mol/LCaCl2, 0.01mol/LFeCl3 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當其從含鹽量高的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至清水中，在數(shù)分鐘內(nèi)能將胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來，試估計細胞膜所受滲透壓的大小。（設操作溫度為25） 例：一種耐鹽細胞其能積累細胞內(nèi)低分子量鹵化物，適應高滲透壓，解：細胞所受滲透壓按照下式計算：P RTC 8.314298(0.3220.0230.01530.014)1031.94106 Pa解：細胞所受滲透壓按照下式計算：酶解法陽性菌：溶菌酶，分解糖苷鍵，低滲溶液破裂陰性菌：EDTA-溶菌酶、甘氨酸-溶菌酶、 青霉素法（抑制細胞壁合成）酵母菌：蝸牛酶、纖維素酶霉菌：幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶

10、自溶作用：加熱、干燥誘發(fā)酶解法南農(nóng)生物分離工程生物分離1細胞破碎課件凍-融法 細胞 -15冷凍、室溫融化 細胞膜疏水鍵破裂，胞內(nèi)水結(jié)晶膨脹破裂 溫和、破碎率低凍-融法干燥法 細胞膜滲透性改變，易抽提（丙酮、丁醇） 空氣干燥（酵母）25-30熱空氣 真空干燥（細菌） 噴霧、冷凍干燥（不穩(wěn)定生化物質(zhì)）干燥法非機械法優(yōu)點：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞??；D、對外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低。非機械法機械法和非機械法的比較 機械破碎法缺點：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細胞碎片大小不一，難分離。

11、 非機械破碎法缺點：A、引起新的污染，尤其是其他化學方法；B、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。機械法和非機械法的比較 機械破碎法缺點：細胞破碎的評價 破碎率定義N0：原細胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細胞。N0和N的可通過直接計數(shù)和間接計數(shù)法得到。直接計數(shù)法方法：樣本稀釋 - 染色 - 上樣 計數(shù)。計算：同上。優(yōu)點：方法簡單。缺點：A、計數(shù)時間長 B、細胞聚集時，不利計數(shù) C、染色誤差。細胞破碎的評價 破碎率定義細胞破碎的評價間接計數(shù)法方法：樣本離心 - 取上清液 - 測特定蛋白質(zhì)或酶 - 與理論的最大值比較。(紫球藻細胞 藻紅蛋白) 計算：Y(%)=100(R/ Rm)Rm：理論最大值

12、，R：實驗測得值。 優(yōu)點：A、方法客觀可靠，尤其對蛋白質(zhì)和酶，B、有多種選擇的指標，胞內(nèi)位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，靈活性大。缺點：影響因素多，如溫度、pH值、剪切力、溶液的稀釋等。解決辦法：篩選相對穩(wěn)定和恒定的指標。細胞破碎的評價間接計數(shù)法基因工程表達產(chǎn)物存在的問題A、包含體B、N-端多一個蛋氨酸殘基、表達產(chǎn)物未糖基化（大腸桿菌）C、表達產(chǎn)物過度糖基化，目標產(chǎn)物變成抗原（酵母）D、大腸桿菌的內(nèi)毒素包含體（一般步驟）A、包含體的分離B、包含體溶解、變性、還原，一般用尿素、鹽酸胍、SDSC、變形蛋白質(zhì)的復性D、一般的分離純化基因工程表達產(chǎn)物存在的問題基因工程表達產(chǎn)物例：人-干擾素的后處理

13、工藝發(fā)酵液 離心(發(fā)酵液冷卻至10C以下，4000r/min離心10min)菌體 細胞破碎(1倍體積細胞+10倍體積 buffer, 冰浴超聲破碎5次, 30s/次, 4000r/min離心30min)，洗滌(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min離心20min，重復三次)包含體 提取變性(包含體+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室溫攪拌2h, 離心(15000r/min, 30min)DTT二硫蘇糖醇用于蛋白質(zhì)二硫鍵的裂解 基因工程表達產(chǎn)物例：人-干擾素的后處理工藝基因工程表達產(chǎn)物變性液 稀釋(取1份