細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法培訓(xùn)課件

1、1143細(xì)菌內(nèi) 毒素檢查法培訓(xùn)內(nèi)毒素基礎(chǔ)知識(shí)儀器試劑的簡單介紹和實(shí)驗(yàn)原理1 1 4 3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法-凝膠法檢 查內(nèi)毒素發(fā)現(xiàn)的歷史1892年,科學(xué)家Richard在研究 霍亂弧菌的時(shí)候,發(fā)現(xiàn)革蘭陰 性菌細(xì)胞壁外膜中有一種不溶 性成分,它能夠引起人體發(fā)熱、 休克、器官損害等病理表現(xiàn)， 因其毒性效應(yīng)和性質(zhì)與外毒素 有顯著差異，就用內(nèi)毒素這一 術(shù)語來描述該物質(zhì)。隨后多年 對(duì)革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的超 微結(jié)構(gòu)技術(shù)和生物分析技術(shù)， 證實(shí)內(nèi)毒素是磷脂雙分子層結(jié) 構(gòu)。 內(nèi)毒素的組成O特異性抗原脂質(zhì)A核心多糖內(nèi)毒素的定義和危害內(nèi)毒素（Endotoxin） 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁 外膜的脂多糖（LPS） 成分，是

2、革蘭陰性菌 生長時(shí)釋放或死亡后，裂解出來的其中起主要致病作用 的是非結(jié)合的游離脂 多糖（FLPS）。內(nèi)毒素能夠直接作用于 人體，激活組織內(nèi)的炎 性細(xì)胞和炎癥因子，導(dǎo) 致機(jī)體發(fā)熱并產(chǎn)生全身 性炎癥反應(yīng)，繼而引起 彌散性血管內(nèi)凝血、休 克、多臟器功能衰竭等 嚴(yán)重的病理生理癥狀， 危及生命。定義危害人體內(nèi)毒素的來源內(nèi)源性途徑外源性途徑注射藥品及溶液開放性創(chuàng)傷燒傷骨折感染休克大手術(shù)術(shù)后肝臟疾病儀器試劑的介紹及實(shí)驗(yàn)原理人體液檢測(cè)專用鱟試劑盒湛江博康海洋生物制品有限公司生產(chǎn)BET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀天津大學(xué)天大天發(fā)科技有限公司生產(chǎn)儀器特點(diǎn)檢測(cè)速度快穩(wěn)定性更好 檢測(cè)范圍廣標(biāo)曲輸入易存儲(chǔ)空間大 靈敏度更高

3、試劑盒特點(diǎn)鱟試劑是唯一能夠檢測(cè)內(nèi)毒素水平的生物試劑采用更為準(zhǔn)確的動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行檢測(cè)鱟試劑盒由鱟試劑、I號(hào)II號(hào)檢測(cè)前處理液、除菌 除熱原試管和采血管、吸頭及檢測(cè)用水組成精心設(shè)置血液前處理流程，有效去除血細(xì)胞和蛋白的干擾，準(zhǔn)確評(píng)估待測(cè)樣本中的內(nèi)毒素水平采用內(nèi)毒素國家工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)控測(cè)評(píng)，保 證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無誤采用國際通用的內(nèi)毒素活性單位（EU/ml）來準(zhǔn) 確衡量待測(cè)樣本中的內(nèi)毒素致病效能鱟試劑的發(fā)明1968年1月Jack Levin和 Frederik B.Bang教授在 美國馬塞諸塞州Wools Hole海洋生物實(shí)驗(yàn)室成 功分離提取鱟血細(xì)胞并 研制成能夠檢測(cè)細(xì)菌內(nèi) 毒素的鱟試劑，開辟了 人類

4、認(rèn)識(shí)和檢測(cè)內(nèi)毒素 的新紀(jì)元！鱟20世紀(jì)六十年代，人 們發(fā)現(xiàn)一種古老的海 洋生物，被稱為“海 洋活化石”的鱟，它 的血液與內(nèi)毒素接觸 后會(huì)發(fā)生特異性的凝 集反應(yīng)，人們經(jīng)過大 量研究和實(shí)驗(yàn)從它的 血液中提取出了用來 檢測(cè)內(nèi)毒素的“鱟試 劑”。內(nèi)毒素的單位EU/ml 1BET-24A采用國際 通用的內(nèi)毒素活性 單位EU/ml來表示 檢測(cè)出的內(nèi)毒素結(jié) 果；2活性單位指的是在 生物試劑在檢測(cè)某 些具有某些活性的 生物時(shí)，它測(cè)得的 是這種生物說是致 病力，而不是這種 生物的重量；3不同的G菌釋放的 內(nèi)毒素活性不同，而 對(duì)臨床最有診斷價(jià)值 的是觀測(cè)到的內(nèi)毒素 的致病力大小，所以 內(nèi)毒素水平用活性單 位來表示

5、更客觀，更 有科學(xué)意義。1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國際單位(IU)相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)原理 內(nèi)毒素與鱟試劑的凝膠反應(yīng)光密度OD時(shí)間（分鐘）通過鱟試劑與內(nèi) 毒素溶液混合會(huì) 發(fā)生凝集反應(yīng)產(chǎn) 生濁度變化，通 過濃度時(shí)間反 應(yīng)曲線，得出待 測(cè)樣品的內(nèi)毒素 濃度； 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 鱟試劑與內(nèi)毒素 反應(yīng)是特異性的 “S”曲線，取 光密度值為0.02 點(diǎn)時(shí)作為反應(yīng)終 點(diǎn)時(shí)間，內(nèi)毒素 的濃度與反應(yīng)時(shí) 間成反比 檢測(cè)內(nèi)毒素的方法定性檢測(cè)凝膠法定量檢測(cè)光度（濁度）法顯色（比色）法動(dòng) 態(tài) 濁 度 法終 點(diǎn) 濁 度 法動(dòng) 態(tài) 顯 色 法終 點(diǎn) 顯 色 法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩 種方法，即凝膠法和光 度測(cè)定法 ，后者包括濁 度法和顯色基

6、質(zhì)法。供 試品檢測(cè)時(shí)，可使用其 中任何一種方法進(jìn)行試 驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭議 時(shí)，除另有規(guī)定外，以 凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)的特點(diǎn)動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)的特點(diǎn)利用細(xì)菌內(nèi)毒素在與鱟試劑形成凝 膠過程中濁度動(dòng)態(tài)變化定量測(cè)定細(xì) 菌內(nèi)毒素水平 動(dòng)態(tài)濁度法法檢測(cè)范圍寬，檢測(cè)范 圍為 0.005EU/ml 100EU/ml，應(yīng) 用范圍廣 對(duì)樣本的內(nèi)毒素含量可以定量檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，適合用于臨床體 液細(xì)菌內(nèi)毒素引起發(fā)熱及重癥疾病 的早期診斷檢測(cè)幾種檢測(cè)方法的比較凝膠法檢測(cè)的特點(diǎn) “限量”檢測(cè)，是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法；凝膠法是以試管內(nèi)反應(yīng)物凝 膠牢固程度為判斷標(biāo)準(zhǔn)， 易受人為因素影響；限量檢查的最低檢測(cè)

7、限僅為 0.035EU/ml，因供試品稀 釋倍數(shù)所限，容易被供試 品干擾，誤差大。因此， 凝膠法不適合在臨床用于 體液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；顯色法檢測(cè)的特點(diǎn)顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi) 毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶 使特定底物顯色釋放出的呈色 團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的 方法，根據(jù)產(chǎn)物顏色判斷內(nèi)毒 素濃度。此法試劑較昂貴，操作較復(fù)雜，在一定范圍之內(nèi)靈敏度、 特異性較高，但檢測(cè)范圍窄；內(nèi)毒素限值的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 (L )一般按以下公式確定：L = K / ML 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 ，一般以 EU/ml、 EU/mg或 EU/U (活性單位)表示；K 為人每千克體重每小時(shí)最大可接

8、受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg h)表 示 ，注 射劑 K = 5EU/(kg h)， 放射性藥品注射劑K = 2.5EU/(kg h)，鞘內(nèi)用注射劑 K =0.2EU/(k g h);M 為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以 ml/(k g h)、mg/(k g h) 或U/(k g h)表示，人均體重按 60k g計(jì)算 ，人體表面積按1.62m2計(jì) 算 。 注 射時(shí)間若不足1小時(shí)，按 1 小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以 0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量(M)按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。確定最大有效稀釋倍數(shù)（MV

9、D)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)， 在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以下公式 來確 定MVD:MVD= cL/L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L 以 EU/mg或 EU/U 表示 時(shí)，c 的單位需 為mg/ml或 U/m h 當(dāng) L 以EU/ml表 示時(shí)，則 c 等于 1.0ml/ml。如需計(jì) 算在MVD時(shí)的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c = /L ； 為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml)，或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。列：如毒素限值是L= 0.05EU/mg =0.125E

10、U/ml那么MVD是多少？這個(gè)問題從以下幾個(gè)方面考慮：1、內(nèi)毒素限值L=0.05EU/mg，2、最大稀釋倍數(shù)是多少，按照MVD=cL/，根據(jù)你的表述，已知L和（0.125EU/ml），需要計(jì)算MVD值需要供試品濃度，否則無法計(jì)算最大稀釋倍數(shù)（MVD）的。3、按照你所表述的MVD=1時(shí)，你的供試品濃度c必須且只能是0.125/0.05=2.5mg/ml， 否則，你的MVD將不會(huì)是1。4、當(dāng)按照MVD=cL/計(jì)算所得MVD=1時(shí)，也就是你的供試品原液不需要任何稀釋。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為 鱟試劑的標(biāo)示靈敏度， 用 EU/ml表示。當(dāng)使用

11、新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件 發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值( )，將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素 工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解， 在旋渦混合器上混勻15分鐘或參 照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作，然后制成 2、 、0.5 和 0.25 四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻 30秒或參照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作。取不同濃度的內(nèi)毒 素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積（如 0.1ml) 的鱟試劑溶液混合，每一個(gè)內(nèi)毒素 濃度平行做4管；另外取2管加人等體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì) 照。將試管中溶液輕輕

12、混勻后，封閉管口，垂直放人37C 1 的恒溫器 中，保溫60分鐘士2 分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且 凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、 變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)，造成 假陰性結(jié)果。 當(dāng)最大濃度2 管均為陽性，最低濃度 0.25 管均為陰性， 陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均 值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值( ） c= antilg (x/n)X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(Lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃 度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度；n 為每個(gè)濃度的平行管

13、數(shù)。當(dāng) c在 0.5 2 (包括 0. 5和 2 )時(shí) ，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并 以標(biāo)示靈敏度 為該批鱟試劑的靈敏度。干擾試驗(yàn) 按表1制備溶液A 、B 、C 和 D，使用的供 試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過 最大有效稀釋倍數(shù) (MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。注 ：A 為供試品溶液 ；B 為干擾試驗(yàn)系列 ；C 為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列 ；D 為 陰 性 對(duì)照。只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D 的所有平行管都為陰性 ，并且系列溶液C 的結(jié)果符合鱟試劑 靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)系列溶液 B 的結(jié)果符合鱟試劑靈 敏度復(fù)核試驗(yàn)要 求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作

14、用。 其他情況則認(rèn)為供試品在詼濃度下存在干擾作用。 若供試品 溶液在小于M V D的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品 溶液進(jìn)行不超過M V D 的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。 可通過對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的 方法（如過濾、中和、透析或加熱處 理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使 用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的 品種建立內(nèi)毒素檢査法時(shí)，須進(jìn)行 干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā) 生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的 變化時(shí)，須重新進(jìn)行干

15、擾試驗(yàn)(1) 凝膠限度試驗(yàn)按表2制備溶液 A 、B 、C 和 D。使用稀釋倍數(shù)不超過 M VD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A 和 B。 按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對(duì)照；C為陰性對(duì)照；D為陽性對(duì)照；結(jié)果判斷 保溫60后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液分鐘2 分鐘D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液C的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。 若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液個(gè)平行管均為陽性，判定供試A 的兩品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若

16、所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，可將供試品稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。 (1) 凝膠半定量試驗(yàn) 本方法系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素 的含量。按表 3 制備溶液 A 、B 、C 和 D。按 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。 注 ：A 為不超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液 。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開 始 用檢查用水稀釋如1倍 、2倍 、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。B為含2濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液 A（供試品陽性對(duì)照 ）C 為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列 D 為陰性對(duì)照 。 結(jié)果判斷若陰性對(duì)照溶液 D 的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B 的平行管均為陽性，系列溶液 C 的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5 2，試驗(yàn)有效。系列溶液A 中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以， 為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃 度。如果檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的供試 品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行