高級生化試驗紫外分光光度法的應用課件

1、紫外分光光度法的應用紫外分光光度法的應用一、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色由物質(zhì)與光的相互作用方式?jīng)Q定。人眼能感覺到的光稱可見光，波長范圍是：400760nm。讓白光通過棱鏡，能色散出紅、橙、黃、綠、藍、紫等各色光。單色光：單一波長的光復合光：由不同波長的光組合而成的光，如白光。光的互補：若兩種不同顏色的單色光按一定比例混合得到白光， 稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。一、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色由物質(zhì)與光的相互作用方式物質(zhì)的顏色：是由于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。 即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補色。無色溶液：透過所有顏色的光有色溶液：透過光的顏色黑色： 吸收所

2、有顏色的光白色： 反射所有顏色的光物質(zhì)的本色物質(zhì)的顏色：是由于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。 完全吸收完全透過吸收黃光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復合光藍光無色黑色物質(zhì)的顏色與光的關系完全吸收完全透過吸收黃光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復合光藍光無色黑 基于物質(zhì)吸收紫外或可見光引起分子中價電子躍遷、產(chǎn)生分子吸收光譜與物質(zhì)組分之間的關系建立起來的分析方法，稱為紫外可見分光光度法（UV-vis）。二、紫外-可見分光光度法（1）靈敏度高，可測到10-7g/ml。（2）準確度好，相對誤差為1%-5%，滿足微量組分測定要求。（3）選擇性好，多種組分共存，無需分離直接測定某物質(zhì)。（4）操作簡便、快速、選擇性好、

3、儀器設備簡單、便宜。（5）應用廣泛，無機、有機物均可測定。 基于物質(zhì)吸收紫外或可見光引起分子中價電子躍遷、產(chǎn)生分子紫外-可見分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度透光率T定義：T 取值為0.0 % 100.0 %T = 0.0 % ： 光全吸收T = 100.0 % ：光全透過吸光度（吸收度）AT=ItI0100%顯然，T，溶液吸收度；T ，溶液吸收度。 即透光率T反映溶液對光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。定義：A = lg1T= -lgT = lgI0ItA=-lgT , T=10-AtI0 = It + Ia + Ir吸收光反射光透過光 Ia T與A關系：IrA1/T，T=0

4、，A= ，T=100%，A=0紫外-可見分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比爾(Beer)分別于1760年和1852年研究吸光度與溶液厚度和其濃度的定量關系：朗伯定律：A=k1 L比爾定律：A=k1 CA=k C L 一束平行單色光通過一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，在入射光的波長、強度以及溶液溫度等保持不變時，該溶液的吸光度A與其濃度C及液層厚度L的乘積成正比。入射光為單色光，適用于可見、紅外、紫外光。均勻、無散射溶液、固體、氣體。吸光度A具有加和性。Aa+b+c= Aa + Ab + Ac 注意!適用范圍朗伯-比爾定律:L2L時，A、T

5、 ？ 2AA=-lgT , T=10-A=10-kcL吸光系數(shù)濃度液層厚度T2二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比爾(Beer)分三、吸光系數(shù)1、摩爾吸光系數(shù)或Em： 在一定下，c=1mol/L，L=1cm時的吸光度。單位：L/(mol.cm)（1）一定條件下是一個特征常數(shù)。（2）在溫度和波長等條件一定時，僅與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關，與待測物濃度c和液層厚度L無關；（3）定性和定量分析依據(jù)：同一物質(zhì)在不同波長時值不同。 不同物質(zhì)在同一波長時值不同。 max表明了該物質(zhì)在最大吸收波長max處的最大吸光能力。 4、吸光系數(shù)的意義: 2、百分吸光系數(shù) / 比吸光系數(shù) ：3、兩者關系:A=k c L

6、k = A /c L 一定下,c=1%(W/V)，L=1cm時的吸光度。單位：100ml/g.cm 1g/100ml三、吸光系數(shù)1、摩爾吸光系數(shù)或Em：（1）一定條件下是一個1定義：以A為縱坐標， 為橫坐標，繪制的A曲線。四、吸收光譜（吸收曲線）2吸收光譜術語： 吸收峰max ,吸收谷min 肩峰sh , 末端吸收 強帶： max104，弱帶： max0.01mol/L)會使C與A關系偏離定律：粒子相互作用加強，吸光能力改變。溶液對光的折射率顯著改變。故：朗伯比耳定律只適用于稀溶液。 溶液中存在著離解、聚合、互變異構、配合物的形成等化學平衡時。使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。 例： 鉻酸

7、鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時溶液pH 對測定有重要影響。（一）化學因素朗比耳定律假定所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；該定律適用于稀溶液，溶質(zhì)的離解、締合、互變異構及化學變化也會（二）光學因素1非單色光的影響：入射光為單色光是應用該定律的重要前提：2雜散光的影響：儀器本身缺陷；光學元件污染造成。3反射和散色光的影響：散射和反射使T，A，吸收光譜變形。 通?？捎每瞻讓Ρ刃Ｕ?。4非平行光的影響：使光程，A，吸收光譜變形。（二）光學因素1非單色光的影響：入射光為單色光是應

8、用該定律0.575紫外-可見分光光度計依據(jù)朗伯-比爾定律，測定待測液吸光度A的儀器。（選擇不同波長單色光、濃度）光源單色器吸收池檢測器信號處理及顯示分光光度計外觀分光光度原理圖:0.575紫外-可見分光光度計依據(jù)朗伯-比爾定律，測定待測液一、主要部件1.光源：2.單色器：包括狹縫、準直鏡、色散元件鎢燈或鹵鎢燈氫燈或氘燈可見光源 3501000nm紫外光源 200360nm色散元件棱鏡光柵對不同波長的光折射率不同衍射和干涉,不同波長的投射方向不同玻璃棱鏡:適用于可見區(qū)石英棱鏡:適用于紫外區(qū)高度拋光的玻璃上刻有等寬、等距平行條痕狹縫：進出光狹縫。準直鏡：復合光平行光色散后聚集狹縫最佳寬度:減小狹縫

9、寬度而溶液吸光度不變。3.吸收池：比色皿、比色杯，裝樣品溶液。有玻璃、石英杯兩種4.檢測器：光電，光電池(硒,硅)，光電管(紅,紫)，光電倍增管。5.信號處理顯示器：放大較弱的電信號，并在檢流計上顯示出來。一、主要部件1.光源：2.單色器：包括狹縫、準直鏡、色散元件比色皿：玻璃VS石英杯適用的波長范圍不一樣 石英的范圍更廣,波長最小可以到達210nm,可以用在紫外光程,一般測核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上測什么試劑都可以,但價格高,一般一個都要在幾百塊人民幣 玻璃的局限性大一些,主要用于可見光程,相對便宜 現(xiàn)在市場上塑料比色皿也在流行起來,但主要還是歐美地區(qū)使用的最多,特點是價格便宜,不怕摔

10、,可以一次性試用,省時省力,也更安全,也分不同材質(zhì),但波長范圍仍然還是比石英比色皿小一些光學玻璃適用透過率：320nm-2500nm 紫外石英適用透過率：190nm-2500nm比色皿：玻璃VS石英杯適用的波長范圍不一樣 二、分光光度計類型 單波長分光光度計雙波長分光光度計單光束分光光度計雙光束分光光度計可見光區(qū):可紫外-見光區(qū):721型751，754型760型儀器簡單，單色光誤差大儀器簡單，要求光強度穩(wěn)定高普遍采用的光路wfz800-S,日本島津UV-300型特定情況（背景、共存組分干擾）下使用各種分光光度計使用化學教學網(wǎng)視頻操作二、分光光度計類型 單波長分光光度計雙波長分光光度計單光第四節(jié)

11、 分析條件的選擇一、 測量條件的選擇 1.吸光度的范圍：T 20%65%，A0.20.7之間吸收最大的波長為入射光，干擾最小二、顯色反應條件的選擇 顯色反應：將試樣組分轉(zhuǎn)變成有較強吸收的有色化合物的反應。顯色劑：與被測組分化合生成有色物質(zhì)的試劑。 1. 顯色反應的條件：(1) 定量反應、選擇性要好； 干擾少。(2) 靈敏度要高，摩爾吸光系數(shù)大。 (3) 有色化合物的組成要恒定，化學性質(zhì)要穩(wěn)定。(4) 有色化合物與顯色劑的最大吸收波長之差60nm。(5) 顯色反應的條件要易于控制。2.測定波長的選擇： M 十 R MR（被測物）（顯色劑）（有色配合物）第四節(jié) 分析條件的選擇一、 測量條件的選擇

12、1.吸光度的范圍三、參比溶液（空白溶液）的選擇 用于調(diào)節(jié)100%T，若選擇不適當，對測量讀數(shù)的影響較大。主要是消除溶液中其他組分對光的吸收等帶來的影響。1. 溶劑參比液 當試液、試劑、顯色劑均無色時，用溶劑(通常是蒸餾水)作參比液； 3. 試劑參比液 如果顯色劑或其他試劑略有吸收，可用不含待測組分的試劑溶液作參比溶液。2. 試樣參比液 如果試樣中的其他組分也有吸收， 但不與顯色劑反應，則當顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液。 4. 平等操作參比液 用不含待測組分的溶液，在相同條件下與待測試樣同時進行處理，此為平行操作參比溶液。三、參比溶液（空白溶液）的選擇 用于調(diào)節(jié)100%T，定性與定量分

13、析紫外-可見分光光度法主要用于有機物分析。定性分析：比較吸收光譜特征可以對純物質(zhì)進行鑒定及雜質(zhì)檢查；定量分析：利用光吸收定律進行分析 （一）定性鑒別：一、 定性分析 對比法：比較樣品化合物的吸收光譜特征與標準化合物的吸收光譜特征；或與文獻所載的化合物的標準譜圖進行核對。同一物質(zhì)有相同吸收光譜圖，反之不一定是同一物質(zhì)。定性與定量分析紫外-可見分光光度法主要用于有機物分析。（一）咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標準品；下：樣品咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標準品；下：樣品2、對比吸光度（或吸光系數(shù)）相同條件下，同一物質(zhì)吸光度比值是吸光系數(shù)的比值。（二）純度檢查 1、雜質(zhì)檢查：有雜質(zhì)時，吸

14、收光譜變形。2、雜質(zhì)限量檢查：以某一波長吸光度值表示； 以峰谷吸光度比值表示。3、對比吸收光譜的一致性將試樣與已知標準樣品用同一溶劑配制成相同濃度的溶液，在同一條件下分別掃描吸收光譜，核對其一致性。1、對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：max、 min、 sh不同基團化合物可能有相同的max值，但max有明顯差別；有相同吸光基團同系物，其max、 max值接近 ，但分子量不同，E1%1cm差別大。A1/A2=E1/E22、對比吸光度（或吸光系數(shù)）相同條件下，同一物質(zhì)吸光度比值是例1：阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測在312

15、nm處是否有吸收峰，即可判斷有無水楊酸。例2：無水乙醇精制過程中要用苯，測定無水乙醇中是否殘留苯，測定其吸收光譜，乙醇在210 600nm之間無吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以純無水乙醇為參比，對樣品進行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說明有苯殘留。例3：如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm =207，上述VB12注射液原標示濃度為0.05%，求實際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測定的吸光度為0.512，其含量為：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，濃度=0.00247%20=0.049% 例1：

16、阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在28溶劑對紫外光譜的影響 在測定有機物的紫外可見吸收光譜時，在溶解度容許范圍內(nèi)，應盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細結構。 與標準樣品或標準圖譜進行對比時，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應該沒有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與溶質(zhì)沒有相互作用。否則會使光譜線產(chǎn)生移動，低于此波長時，溶劑的吸收不可忽略。溶劑對紫外光譜的影響常用溶劑的波長范圍如下： . 溶劑 使用波長范圍 溶劑 使用波長范圍 甲醇 210 二氯甲烷 235 . 乙醇 215 氯仿 245 . 水 210

17、乙酸乙酯 260 . 96%硫酸 210 苯 280 . 乙醚 215 甲苯 285 . 常用溶劑的波長范圍如下： 二、 定量分析 分光光度法被廣泛的應用在各個領域，環(huán)境、醫(yī)藥、石油等測定無機、有機微量成份。由于操作簡單，儀器廉價，一般說是常用的首選方法。（一）單組分的定量分析1、標準曲線（工作曲線）法：配制一系列不同濃度的標準溶液，在同一條件下分別測定吸光度，然后以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制A-C關系曲線。符合朗-伯定律，則得到一條通過原點的直線。根據(jù)測得樣品吸光度，從標準曲線中求得樣品溶液濃度，最后計算含量。原理:根據(jù)朗伯-比爾定律，選擇合適測A，求出濃度。二、 定量分析 分光光

18、度法被廣泛的應用在各個領域，環(huán)境、醫(yī)藥2、標準對照法 以該物質(zhì)吸收光譜圖中max為入射光，配制一個與被測溶液濃度相近的標準溶液cS，測其AS，再將樣品溶液推入光路，測其AX，則試樣溶液的濃度cX為：例：VB12含量測定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使其濃度約為30g/ml，另外配VB12標準液濃度為30g/ml，蒸餾水調(diào)零，用361nm測定吸光度A，計算：測定液中VB12含量（g/ml）=（A樣品/A標準品）30；注射液中VB12含量（g/ml）=（A樣品/A標準品）30 n（稀釋倍數(shù)）V（取樣量,ml）2、標準對照法 以該物質(zhì)吸收光譜圖中max為入射光，（二）多組分的定量分

19、析法 在含有多種組分的溶液中，如果要測定多個組分，可以根據(jù)情況的不同，采用不同的方法來進行測定。測量依據(jù)吸光度的加和性：(1)(2)(3)（二）多組分的定量分析法 在含有多種組分的溶液中，如果要(1)圖計算法-兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾） a 圖中，a,b 組份最大吸收波長max不重迭，相互不干擾，可以按兩個單一組份處理。(2) 圖計算法-兩組分吸收光譜部分重疊a、b兩組分的吸收光譜部分重疊，此時1處按單組分測定a組分濃度，b組分此處無干擾。在2處測得混合溶液的總吸光度A2a+b,根據(jù)加和性計算cb，假設液層厚度為1cm,則：A2a+b=A2a+A2b=E2a ca+ E2b cb(1)圖

20、計算法-兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾） a 例：四環(huán)素和金霉素混合物的測定：四環(huán)素在0.25 M NaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，max =372.0；在0.1M HCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，max =303.2 ；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測定波長。但與金霉素共存時，因為金霉素在355nm處有吸收（金霉素在0.1N HCl中E1%1cm，max =182.6），只能用380nm測定四環(huán)素?；旌蠘悠吩?55nm處測定二者的總吸光度,在380nm處測得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測定方法： (1)測定1%混合物在0.1M HCl溶液的吸光度A335

21、 (2)測定1%混合物在0.25M NaOH溶液的吸光度A380 計算：四環(huán)素濃度C1（g%）= AC1，380 / E1%（C1）1cm，380= AC1，380 / 372.0金霉素濃度C2（g%）=AC1+C2335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC1，380372.0）182.6例：四環(huán)素和金霉素混合物的測定：四環(huán)素在0.25 M Na(3) 圖計算法-兩組分吸收光譜完全重疊-混合樣品測定 (3)圖中，a,b 吸收光譜雙向重迭，互相干擾，在最大波長處互相吸收。處理方法如下：1. 解線性方程組法過程：(3) 圖計算法-兩組分吸收光譜完全重疊-混合樣品測2. 等吸收雙波長法-注：須滿足兩個基本條件選定的兩個波長下干擾組分具有等吸收點選定的兩個波長下待測物的吸光度差值應足夠大2. 等吸收雙波長法-注：須滿足兩個基本條件使用注意點1.開機前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出，儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。2.測定紫外波長時，需選用石英比色皿。3. 使用的比色皿必須潔凈，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應無溶劑殘留，切勿用手捏透光面，并注意配對使用，比色皿放入樣品室時應注意方向相同。量瓶、移液吸管均應校正、洗凈后使