實驗動物胚胎工程技術(shù)

1、關(guān)于實驗動物胚胎工程技術(shù)第1頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四2第一節(jié) 概述生物工程： 按照工程學(xué)原理，對生物體或生物大分子進行改造或利用，用于生產(chǎn)、研究、檢定和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)。 遺傳（基因）工程 蛋白質(zhì)工程 酶工程 細胞工程 微生物工程 胚胎工程 組織工程 分子水平細胞水平組織水平第2頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四3胚胎工程（Embryonic engineering）又稱胚胎技術(shù),是指用工程學(xué)的原理對動物的胚胎進行某種技術(shù)操作或改造，使之獲得人們所需要動物的一系列生物技術(shù)的總稱,包括以下四大技術(shù)體系：一、胚胎操作基本技術(shù) 1.超數(shù)

2、排卵和卵母細胞、精子、受精卵的采集 2.體外受精 3.胚胎性別控制 4.胚胎分割 5.胚胎培養(yǎng) 6.胚胎移植 7.胚胎冷凍保存二、體細胞克隆技術(shù) 三、干細胞技術(shù)四、外源基因?qū)爰夹g(shù)第3頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四4 1在畜牧業(yè)方面：通過建立超數(shù)排卵、受精卵/卵母細胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家畜品種的改良。 胚胎工程的應(yīng)用第4頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四5已在乳腺表達的生物活性蛋白并進入臨床2期或3期試驗：抗凝血酶一抗胰蛋白酶蛋白C乳鐵蛋白乳糖酶2在生物制藥方面：通過轉(zhuǎn)基因技

3、術(shù)將具有藥用價值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表達。通過收集、純化這些體液中的生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療某些人類的疾病。第5頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四6 3在醫(yī)學(xué)方面：通過建立卵母細胞的采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥的治療；通過對胚胎培養(yǎng)和檢測，剔除具有遺傳性疾病的胚胎，達到優(yōu)生優(yōu)育的目的。 4在生命科學(xué)研究方面：闡明哺乳動物早期胚胎發(fā)生、發(fā)育機制等基礎(chǔ)理論 5在拯救瀕危野生動物方面：通過野生動物生殖細胞和組織的冷凍保存、體細胞克隆和胚胎移植技術(shù)，擴大野生動物的種群。第6頁，共71頁，2022年，5

4、月20日，0點53分，星期四7第二節(jié) 胚胎操作基本技術(shù)第7頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四8胚胎操作的整個過程局限在胚胎的早期發(fā)育第8頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四9解剖取附睪尾部精子的獲取和培養(yǎng)1.精子的采集 嚙齒類小動物精子的采集大都從體成熟雄性動物的附睪獲取。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。大動物的精液采集可采用假陰道或電刺激方法促進雄性射精，收集精液。一、精子、卵母細胞、受精卵的采集和超數(shù)排卵第9頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四102.卵母細胞和受精

5、卵的采集 在哺乳動物中獲得卵母細胞的途徑有兩條：從體內(nèi)成熟并排到輸卵管中去，需通過處死動物或外科手術(shù)獲取；如果在交配后，則可獲取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或剛死亡的雌性動物的卵巢，從卵巢中分離卵母細胞經(jīng)培養(yǎng)而得。小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細胞/受精卵的方法第10頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四11 3.超數(shù)排卵（Superovolation）技術(shù)：通過注射激素刺激卵巢大量排卵。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動物卵巢大量的卵泡同時成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十幾倍，一次可獲得大量的卵細胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和

6、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三種常用。第11頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四12檢查陰栓：妊娠0.5天中午12時中午12時上午8時24小時24小時20小時注射PMSG注射hCG小鼠超數(shù)排卵程序放到種公鼠籠內(nèi)受精卵注射PMSG注射hCG晚上5-6時晚上5-6時24小時24小時卵母細胞采 集15小時第12頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四13 體外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子與卵母細胞在體外環(huán)境下完成受精的過程。這一過程包括卵母細胞的收集或未成熟卵母細胞的培養(yǎng)成熟、精子的獲取、獲能處

7、理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。 體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）又稱試管嬰兒。 二、體外受精第13頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四14 性別控制的研究，是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項重要的高新技術(shù)。這項技術(shù)的應(yīng)用，可以使畜牧上大動物的繁殖按照人們的意愿只生產(chǎn)同一性別動物。 在醫(yī)學(xué)上，性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進行性肌營養(yǎng)不良，為X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異?；虻话l(fā)病。攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，則可避免男性患兒的出生。 三、胚胎性別控制第14頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四15性別控制技

8、術(shù)通過對X精子與Y精子分離以控制性別在胚胎移植前對胚胎的性別進行鑒定以控制性別通過控制飼料特性、受精環(huán)境如改變精液或陰道的PH值等來控制性別。 第15頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四16（一）分離X精子與Y精子以控制性別 分離X精子與Y精子的依據(jù)：X、Y精子在體積、密度、電荷、運動性和DNA含量、表面抗原等方面存在差異。將X和Y精子分離再通過人工授精可以有效地達到性別控制的目的。 目前將X和Y精子分離的方法有沉降法、電泳法、免疫法和流式細胞儀法等。流式細胞儀法是當(dāng)前分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法，具有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性的特點。第16頁，共71頁，2022年，5月20日，

9、0點53分，星期四17 應(yīng)用流式細胞儀分離X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。對于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8，由于染料著色量與精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光就比Y精子強。正常人染色體第17頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四18 具體的做法是：先用DNA特異性染料對精子進行活體染色，然后精子連同少量稀釋液逐個通過激光束。探測器根據(jù)精子的發(fā)光強度把電信號傳遞給計算機，計算機指令液滴充電使發(fā)光強度高的液滴帶正電，弱的帶負電。即X精子帶上正電荷，Y精子帶上負電荷。當(dāng)經(jīng)過高壓電場時會向不同方向偏轉(zhuǎn)，達到分離的目的。第18頁，共71

10、頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四19（二）對胚胎進行鑒定以控制性別 在胚胎移植前對胚胎的部分組織用染色體檢查、間接免疫熒光法和PCR法進行性別鑒定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特點，近年來得到迅速的發(fā)展。 Y染色體短臂上有決定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome,全稱:Y染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別鑒定提供了可靠的途徑。第19頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四20第20頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四21受精卵2細胞胚4細胞胚8細胞胚桑椹胚囊

11、胚 胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過程的可能性。四、胚胎培養(yǎng)第21頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四22胚胎培養(yǎng)一般應(yīng)用于以下幾個方面： 1未成熟卵母細胞通過體外培養(yǎng)，成熟后進行體外受精。 2受精卵通過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保存。 3冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。 4通過研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，不斷完善胚胎培養(yǎng)條件，揭示胚胎細胞的生長發(fā)育和分化的奧秘。 目前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以將未成熟卵在體外成熟，并通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。即使如此，在體外胚胎

12、培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動物的子宮內(nèi)。第22頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四23 -胚胎工程的最后一道工序 將受精卵或發(fā)育到一定時期的早期胚胎,移植到受體動物生殖管道的一定部位,能在子宮內(nèi)著床、生長、發(fā)育、分娩、出生仔代動物的技術(shù)稱為胚胎移植。幾乎所有的胚胎工程技術(shù)在體外完成對胚胎的操作后，都需經(jīng)過胚胎移植這一步驟，得到我們所要的動物。五、胚胎移植第23頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四24體外培養(yǎng)的胚胎必須移植到同步發(fā)情的雌性動物生殖管道內(nèi)。解決同步發(fā)情的方法有兩種：1.利用自然同期發(fā)情的母畜，此法在實踐上較難辦到；2.通過注

13、射某些藥物(如孕激素、雌激素等)誘發(fā)同期發(fā)情。 不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2細胞胚胎應(yīng)移植到輸卵管內(nèi)，而桑椹胚和囊胚期胚胎應(yīng)移植到子宮內(nèi)，以跟正常妊娠生殖生理變化同步。第24頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四25同一種屬內(nèi)的不同品種品系可互相進行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封閉群ICR的生殖管道內(nèi)；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西蘭兔的生殖管道內(nèi)。這一特點在畜牧業(yè)特別有用，如為了加快良種奶牛的繁殖，可將良種奶牛的胚胎移植到普通黃牛的生殖管道內(nèi)，借腹懷胎。 第25頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四26 胚胎

14、冷凍保存（embryo cryopreservation）技術(shù)是指在低溫（-196液氮內(nèi)）條件下利用低溫保護劑保存生殖細胞及胚胎的一門技術(shù)。 六、胚胎冷凍保存第26頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四27（一）胚胎冷凍保存的機制 低溫降低了胚胎內(nèi)的生化反應(yīng)速度。并且溫度越低，保存時間就越長。 低溫損傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致細胞的強烈收縮和細胞處于高濃度的溶液中時間過長，從而造成化學(xué)損傷；如果冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及通過細胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成物理損傷。 同樣，在復(fù)溫（解凍）過程中，如果復(fù)溫速率

15、不當(dāng)也可能引起細胞內(nèi)結(jié)冰（重結(jié)冰）而損傷。第27頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四28 采用低溫保護劑防止低溫損傷： 二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等可以避免或減少結(jié)冰的程度與速度，降低細胞周圍未凍結(jié)溶液中的電解質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物理和化學(xué)損傷。第28頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四29 （二）胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用 1. 應(yīng)用于實驗動物的保種和珍稀或瀕危動物種質(zhì)保存。 應(yīng)用于實驗動物胚胎的長途運輸。 應(yīng)用于實驗動物的生物凈化。 應(yīng)用于實驗動物育種和野生動物的實驗動物化

16、。第29頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四30第三節(jié) 動物體細胞克隆技術(shù)第30頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四31 克?。╟lone）的概念 克隆是指無性繁殖或拷貝。 無性生殖在植物中很常見，在動物中過去認為是不可能的。 動物克隆是指生物體通過體細胞核移植生產(chǎn)出基因型幾乎與供體完全相同的后代。第31頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四32 核移植（Nuclear transfer）是指將動物細胞的細胞核移植到另一個體的去核卵母細胞胞質(zhì)中，通過電激活，使供體核重編程序，形成的重構(gòu)卵發(fā)育成胚胎，最后通過胚胎移植，使之發(fā)育成個體。 如

17、果受體去核卵和供體移入的核來自同種動物，則稱種內(nèi)核移植，來自不同的種則稱為種間核移植。核移植由于沒有經(jīng)過精子和卵子的受精過程，核移植動物的全部遺傳信息來自供體核細胞，等于是復(fù)制了提供細胞核的動物，因而把它俗稱為“克隆”。 第32頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四33 根據(jù)供體核的來源不同，核移植包括以下幾種： 胚胎細胞核移植：未著床的囊胚（未分化）胚胎干細胞核移植（未分化）胎兒成纖維細胞：出生前的胎兒（未分化或低分化）成年體細胞（已分化）第33頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四34動物克隆的實驗過程第34頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53

18、分，星期四35動物克隆技術(shù)的意義與應(yīng)用加快良種家畜的繁殖速度與體細胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，能制備大家畜轉(zhuǎn)基因動物拯救瀕危野生動物治療性克隆，用于再生醫(yī)學(xué)第35頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四36再生醫(yī)學(xué)技術(shù)路線簡介第36頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四37第四節(jié) 干細胞技術(shù)第37頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四38一、概述干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細胞分為胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)和成體干細胞(adult stem cells，AS細胞)。E

19、S細胞存在于囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團中，是全能性、無限增殖的干細胞，在胚胎的生長發(fā)育過程中具有分化形成胎兒所有類型細胞、組織和器官的潛能。AS細胞是ES細胞定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細胞的“專能”細胞，包括神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。第38頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四39第39頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四40誘導(dǎo)性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS

20、 細胞)2006 年, Takahashi 等首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化的細胞重編程回歸到胚胎細胞狀態(tài)。他們通過慢病毒載體介導(dǎo)將Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細胞, 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細胞, 命名為“誘導(dǎo)性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細胞)。這一研究克服了ES細胞和AS細胞應(yīng)用存在的諸多問題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細胞主要有血細胞(如T 細胞和B 細胞等)、脂肪細胞和皮膚成纖維細胞

21、。第40頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四41二、胚胎干細胞（ES細胞)來源：ES細胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的內(nèi)細胞群分離出來的未分化細胞。 內(nèi)細胞群:具有未分化特性，可進一步分裂,分化形成內(nèi)、中、外三個胚層。 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等， 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。 由于內(nèi)細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細胞群分離出來后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，我們稱之為ES細胞。第41頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四42 目前除了從小鼠、大

22、鼠和人分離得到并建立ES細胞系外，還未從其它動物的囊胚中分離到ES細胞系。第42頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四43 （二）ES細胞的培養(yǎng) ES細胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級，對培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合，ES細胞容易發(fā)生分化，從而失去ES細胞的特性。 未分化ES細胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過的成纖維細胞飼養(yǎng)層（Feeder cell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細胞為ES細胞提供細胞因子來維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）能更有效地維持未分化的ES細胞

23、。 第43頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四44（三）ES細胞的鑒定 ES細胞是一種正常的胚胎性干細胞，具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能。在建系之初需要對其核型、分化能力和細胞標(biāo)志物進行鑒定 1核型 2體外分化試驗 將ES細胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞的分化。 3體內(nèi)分化試驗 將ES細胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下，2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢查為畸胎瘤。畸胎瘤內(nèi)部有多種細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞以及干

24、細胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4ES細胞的標(biāo)志物 Oct-4: Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）屬POU轉(zhuǎn)錄因子一員，它在全能胚胎干細胞(ES)和生殖細胞表達。該表達對于維持干細胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化導(dǎo)致Oct-4的下調(diào)。 SSEAs: 人ES細胞表達SSEA-3和SSEA-4，但不表達SSEA-1。小鼠ES細胞表達SSEA-1，但不表達SSEA-3或SSEA-4。 第44頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四45（四）胚胎干細胞的應(yīng)用1.用于研究哺乳動物個體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律由于ES細胞可分化為胚胎內(nèi)胚層

25、、中胚層和外胚層中任何一種類型細胞，因此可用遺傳標(biāo)記的ES細胞(如標(biāo)記半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通過組織化學(xué)染色追蹤ES細胞的分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的ES細胞已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。 第45頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四46 2.在體外研究細胞的分化規(guī)律 ES細胞僅在飼養(yǎng)層細胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白細胞介素-6(IL-6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo)ES細胞發(fā)生不同類型的分化，通過

26、研究ES的分化特點可揭示細胞分化和凋亡機理。第46頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四473.用于研究基因的功能和制備基因敲除動物 由于用ES細胞可進行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的ES細胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細胞。 通過篩選獲得陽性細胞，然后用嵌合體或細胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。用于研究未知基因的生物學(xué)功能。第47頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四484. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。利用ES細胞可以誘導(dǎo)分化形

27、成新的組織 細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。目前，在動物實驗方面，用ES細胞誘導(dǎo)分化出的某些組織細胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。第48頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四49 5.培育出人造組織器官，用于器官移植 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過ES細胞體外誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。第49頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四50三、成體干細胞1. 成體干細胞（AS細胞）的來源AS細胞位于出生后體內(nèi)分化成熟的組織之中，具有自我更

28、新和分化潛能，它在分裂時可產(chǎn)生兩個子代細胞，一個與原來干細胞完全一致，另一個向前分化，形成相應(yīng)組織的多功能干細胞，通過分化增殖和更新衰老細胞來構(gòu)筑相應(yīng)的器官，維持正常生理功能?，F(xiàn)在可從骨髓和血液、胎盤、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪、滑膜等多種組織中獲取各種多能干細胞。第50頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四512. AS細胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化取所要分離AS細胞的組織，用酶消化法分散細胞進行體外培養(yǎng)。再用各種技術(shù)從體外培養(yǎng)細胞中分離AS細胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺AS細胞。同ES細胞一樣，AS細胞的誘導(dǎo)定向分化需要細胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、膠質(zhì)細

29、胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等。通常情況下，供體干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。然而在某些情況下干細胞的分化并不遵循這種規(guī)律，如神經(jīng)外胚層來源的NSC能分化為中胚層來源的細胞如肌細胞，肌肉干細胞會分化為各種血細胞系等。所有干細胞中，來源于骨髓的干細胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為造血干細胞(HSC)和骨髓間質(zhì)干細胞(MSC)。第51頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四523. AS細胞的鑒定各種AS細胞都有自己的標(biāo)記物，可利用標(biāo)記物進行鑒定。4. AS細胞的應(yīng)用疾病的替代治療和移植治療 如用造血干細胞治療白血病，造血干細胞在體外誘導(dǎo)分化成心肌細胞來修復(fù)受

30、損傷的心肌，治療心力衰竭。骨髓來源干細胞及其他來源干細胞都可以分化得到成骨細胞，通過將細胞與支架材料結(jié)合后移植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。第52頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四53四、誘導(dǎo)性多潛能干細胞1.iPS細胞的來源iPS 細胞建立的過程主要包括: 分離和培養(yǎng)宿主細胞； 通過病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個多能性相關(guān)的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4）導(dǎo)入宿主細胞； 將病毒感染后的細胞種植于飼養(yǎng)層細胞上, 用ES細胞專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng), 同時在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子化合物，以促進重編程。2.iPS細胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化其培養(yǎng)條件和

31、誘導(dǎo)定向分化的條件基本與ES細胞相同。3.iPS細胞的鑒定iPS 細胞的鑒定與ES細胞相同。第53頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四54如何獲得人ES細胞傳統(tǒng)技術(shù) 1. 用病人的皮膚細胞核移植到人去核卵母細胞人卵母細胞來源問題2. 用病人的皮膚細胞核移植到動物去核卵母細胞倫理問題新技術(shù)1. 用ES細胞特異轉(zhuǎn)錄基因?qū)肴似つw細胞，直接轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）(2007年）安全問題2. miRNAs直接將皮膚細胞轉(zhuǎn)化為iPS(2010年） 以病毒為載體，向老鼠的成纖維細胞中注入4個基因，將其改造為細胞，然后在此基礎(chǔ)上培育出一個老鼠胚胎，再把它植入代孕實驗鼠的體內(nèi)。20天

32、后，一只黑色的小老鼠出生。 第54頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四554.iPS細胞的應(yīng)用iPS 細胞與ES細胞相比,具有很多優(yōu)勢。iPS細胞的來源更方便、更豐富，可以通過有限的幾個轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)染直接誘導(dǎo)各種不同動物的體細胞來獲取多能性干細胞，而不需要通過ES細胞途徑，克服了許多動物至今未分離出ES細胞的問題。iPS細胞的產(chǎn)生不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克服了使用人胚胎進行實驗的倫理問題，可見iPS細胞必然成為未來相當(dāng)長一段時間內(nèi)的研究熱點。目前, 科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細胞中誘導(dǎo)并獲得iPS 細胞。第55頁，共71頁，2022年，5月

33、20日，0點53分，星期四56第五節(jié) 外源基因?qū)肱咛ゼ夹g(shù)第56頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四57 將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾種方法：一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi) 顯微注射法： 在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA直接注入到受體的受精卵雄性原核內(nèi)。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細胞時，外源基因可整合到宿主細胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。 精子載體法： 將外源DNA與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi)。 第57頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四58二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細

34、胞或體細胞，再將轉(zhuǎn)染的細胞作為供體核移植到去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎。 1.將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞或體細胞： 電穿孔法：細胞暴露于高電壓時，細胞膜為高電壓瞬時擊穿，從而使外源DNA被攝入細胞中。 脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源DNA裝入脂質(zhì)體，與培養(yǎng)細胞一起溫育，即可將外源DNA導(dǎo)入受體細胞。 基因槍法： DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法： 磷酸鈣介導(dǎo)法： 第58頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四592.帶有外源基因的ES細胞通過崁合體技術(shù)進入囊胚胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細胞組合起來，由此而發(fā)育形成的動物稱為嵌合體動物。由于嵌合體動物是兩類遺傳背景不同的胚胎發(fā)育

35、形成的，不同細胞群體互相嵌合構(gòu)成了器官和組織，但嵌合體動物攜帶的兩種遺傳特性不能同時遺傳給下一代的同一個體。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細胞（精子或卵子）。分化成生殖細胞的親本的遺傳特性能傳給后代。第59頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四60嵌合體動物的制備：1.聚合法 用聚合法制作嵌合體動物，是將遺傳上不同（例如毛色不同）的兩個816細胞胚胎用物理方法聚合起來。2.注射法 注射法是將胚胎干細胞或其他胚細胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。第60頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四613.帶有外源基

36、因的體細胞通過克隆技術(shù)進入胚胎將帶有外源基因的體細胞作為供體，通過核移植技術(shù)克隆到去核卵母細胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕動物的子宮中。出生后動物的基因型與供體的基因型完全一致。第61頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四62 外源基因進入細胞后的命運 外源DNA進入細胞后有三種命運： 1被胞內(nèi)酶降解。 2以游離狀態(tài)存在。游離的未整合外源DNA只要有真核細胞能識別的啟動子、編碼基因以及poly(A)信號等，一般都能得到表達，但隨著細胞衰老，表達力下降。這種表達不能傳代，稱為暫時表達。 3整合到受體細胞染色體（只有少數(shù)）。整合到受體細胞基因組的外源基因，能隨細胞分裂遺傳到子

37、細胞，稱為穩(wěn)定表達。第62頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四63DNA構(gòu)件導(dǎo)入細胞的方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因電穿孔電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染生殖細胞或早期胚胎ES細胞體細胞隨機整合定點整合或隨機整合定點整合或隨機整合第63頁，共71頁，2022年，5月20日，0點53分，星期四64 外源基因整合到受體細胞染色體可分為以下兩種情況： 隨機插入（Random insertion）：外源基因進入細胞后，隨機插入到任意的染色體內(nèi)。如果插入到一個基因內(nèi)，可能導(dǎo)致該基因的失活。另外，插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響，其表達可能高，也可能低。 定點整合（Targeted integration）：實現(xiàn)定點整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點整合部位的同源DNA序列，即所謂的同源臂（Homologous arm）。當(dāng)外源基因載體進入細胞后，同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近，通過同源重組，