體外受精的技術(shù)

1、關(guān)于體外受精技術(shù)第1頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外受精的概念狹義：將動(dòng)物受精過程中的精卵結(jié)合在體外環(huán)境下完成的現(xiàn)象。包括自然條件下的體外受精(兩棲類和魚類)，和人為培養(yǎng)條件下的體外受精(哺乳動(dòng)物)。廣義：經(jīng)過特殊處理的精子在體外使卵母細(xì)胞受精的技術(shù)，所以體外受精的胚胎移植后所生嬰兒又稱為“試管嬰兒”。包括卵母細(xì)胞的體外成熟和受精卵的體外培養(yǎng)兩項(xiàng)配套技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：與體內(nèi)受精相比，所需精子數(shù)減少，提高精液利用率。Example: 流式細(xì)胞含儀分離的性控精子只能用于體外受精。第2頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 1878年，Sch

2、enk(Germany)將體內(nèi)成熟的家兔和豚鼠卵子與附睪精子放入子宮液中培養(yǎng)，觀察到第二極體的排出和卵裂現(xiàn)象； 1945年，張明覺(華裔)偶然獲得兔體外受精卵，但無重復(fù)性，且無試管動(dòng)物出生； 1951，張明覺與Austin(澳)同時(shí)發(fā)現(xiàn)精子獲能現(xiàn)象；1959年，他首次獲得體外受精兔； 80年代以來，對(duì)胚胎需求量的加大，促進(jìn)了家畜體外受精的研究，牛、綿羊、山羊、豬等體處胚相繼獲得了成功，國(guó)內(nèi)90年代在家畜上也獲得了成功； 現(xiàn)已將卵母細(xì)胞體外成熟-體外受精-早期胚體外發(fā)育-冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化胚胎生產(chǎn)。第3頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀世界體外受

3、精的首創(chuàng)紀(jì)錄 動(dòng)物種類 首創(chuàng)紀(jì)錄文獻(xiàn) 兔 Thibault(1954) 敘利亞倉(cāng)鼠 Yanaginmachi,chang(1963) 小鼠 Whittingham(1968) 中國(guó)倉(cāng)鼠 Pickworth,Chang(1969) 貓 Hammer(1970) 土撥鼠 Yanagimachi(1972) 大鼠 Miyamoto,Chang(1973) 狗 Mahi,Yanagimachi(1976) 牛 Brackett(1978) 豬 Iritani,Niwa(1977) 綿羊 Bondioli,Wright(1980) 山羊 花田章(1985) 第4頁，共71頁，2022年，5月20日，19

4、點(diǎn)26分，星期四國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀我國(guó)體外受精的首創(chuàng)紀(jì)錄 動(dòng)物種類 首創(chuàng)紀(jì)錄文獻(xiàn) 小鼠 陳秀蘭(1986) 兔 范必勤(1987) 綿羊 旭日干(1989) 牛 旭日干(1989) 山羊 錢菊汾(1990) 豬 范必勤(1990) 水牛 蔣和生(1993) 第5頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外受精技術(shù)流程 卵母細(xì)胞的體外成熟 精子的體外獲能 卵母細(xì)胞的體外受精 受精卵的體外發(fā)育 配子的冷凍保存第6頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)1. 離體采集：30min內(nèi)取卵巢，置生理鹽水或PBS（25-35），3

5、h內(nèi)回收。 卵泡抽吸法： 針頭穿刺，一次進(jìn)針可抽吸卵巢皮質(zhì)的多個(gè)卵泡 優(yōu)點(diǎn)：回收速度快，不易造成卵母細(xì)胞的污染； 缺點(diǎn)：容易損傷卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，影響其隨后的成熟。 第7頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集 卵巢解剖法：卵巢切為兩半，去掉中間的髓質(zhì)部分，刀片劃破卵泡，在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗 優(yōu)點(diǎn)：能保持卵母細(xì)胞周圍卵泡細(xì)胞的完整性，回收率也相對(duì)較高；缺點(diǎn)：回收的速度相對(duì)較慢，容易造成污染。 第8頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集2. 活體采集(Ovum Pick-Up,OPU)

6、腔鏡法：腹壁切開一小口，插入腹腔鏡，操作桿和穿刺針，配合將卵母細(xì)胞抽吸出來優(yōu)點(diǎn)：比較直觀，容易掌握；缺點(diǎn)：工作量大，對(duì)母牛有損傷，不能頻繁手術(shù)。第9頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集 B型超聲波法：超聲波探頭和采卵器插入到陰道子宮頸的一側(cè)穹隆處。術(shù)者通過直腸將卵巢貼在探頭上，根據(jù)B超屏幕上所顯示的卵泡位置進(jìn)行穿刺而將卵母細(xì)胞抽出 優(yōu)點(diǎn)：不用手術(shù)，操作速度快，對(duì)母牛損傷小，可頻繁采卵，且亦可對(duì)妊娠母牛采卵；缺點(diǎn)：操作技術(shù)較難掌握，并需要昂貴的超聲設(shè)備。 第10頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵

7、母細(xì)胞的篩選 只有周圍包被著完整卵丘（A級(jí)）或部分卵丘脫落（B級(jí)）(1層以上卵丘細(xì)胞）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。A級(jí)：卵丘細(xì)胞致密，至少有5層以上；B級(jí)：卵丘細(xì)胞為2-4層；C級(jí)：卵母細(xì)胞大部分被包裹；D級(jí)：卵母細(xì)胞少量被包裹；E級(jí)：裸卵。 A、B級(jí)可用于培養(yǎng)，C、D級(jí)成熟率低。第11頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟目的： 提供可利用的卵母細(xì)胞用于體外受精、克隆等； 研究其體內(nèi)成熟的模型。卵母細(xì)胞體外成熟的特征 生發(fā)泡破裂； 染色體凝集； 紡綞體形成； 極體排出； 透明帶軟化；

8、卵丘細(xì)胞擴(kuò)展。第12頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液 以TCM-199較好，可使牛、羊、豬的卵母細(xì)胞體外成熟率高達(dá)80%以上。添加成分： 促性腺激素：FSH、LH FCS、BSA：有認(rèn)為FCS比BSA好，而發(fā)情牛血清或發(fā)情羊血清比FCS好。 抗生素第13頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)Oocyte Collection Medium (OCM) 最常用的是碳酸氫鈉或Hepes緩沖的TCM-199;2. Oocyte Maturation Medi

9、um （1) Bovine steer serum (2) Folltropin (3) Estradiol (4) Na Pyruvate (5) Glutamine 第14頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)2. 成熟培養(yǎng)時(shí)間 一般22h-24h，但豬40h-44h，馬30h-36h，兔僅12h-15h 3. 成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境 人和嚙齒類動(dòng)物：37 牛、豬、羊和馬等：3839。 pH：7.7好于7.1，7.4，8.0 滲透壓：330 Osm/kg好于300，320 氣相： 5%CO2 5%CO25%O290%N2 第1

10、5頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)4.IVM系統(tǒng) 開放培養(yǎng)系統(tǒng) 1ml-2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平皿內(nèi)或培養(yǎng)板內(nèi)，放入50枚-200枚卵母細(xì)胞培養(yǎng)，上面不蓋石蠟油。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，對(duì)培養(yǎng)液中的脂溶性物質(zhì)沒有若影響，能同時(shí)培養(yǎng)大量細(xì)胞 缺點(diǎn)：滲透壓變化較大，容易污染 第16頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 微滴培養(yǎng)系統(tǒng) 將成熟培養(yǎng)液在做成50-500l的微滴，覆石蠟油，將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：滲透壓比較穩(wěn)定，不易污染； 缺點(diǎn)：對(duì)脂溶性物質(zhì)有稀釋作用，成本高

11、，培養(yǎng)結(jié)果易受石蠟油質(zhì)量的影響。 密閉培養(yǎng)系統(tǒng) 置12ml培養(yǎng)液的試管中，膠塞，在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入密閉的塑料袋內(nèi)。 優(yōu)點(diǎn)：不要CO2培養(yǎng)箱，方便運(yùn)輸 缺點(diǎn)：pH不如前者穩(wěn)定。 第17頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志 第一極體的排出、卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展可作為成熟的標(biāo)志，而生發(fā)泡破裂(GVBD)是卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的主要標(biāo)準(zhǔn)，因此常用地衣紅染色才可判斷。牛卵母細(xì)胞體外成熟標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)成熟卵：卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)展，卵丘細(xì)胞至少向外擴(kuò)展3倍于裸卵直徑；2級(jí)成熟卵：卵丘細(xì)胞中等擴(kuò)展，卵丘

12、細(xì)胞至少向外擴(kuò)展2倍于裸卵直徑；3級(jí)成熟卵：卵丘細(xì)胞輕度假擴(kuò)展，卵丘細(xì)胞仍緊緊粘附于透明帶上。 1級(jí)和2級(jí)卵通常均已排出第一極體。第18頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量評(píng)定 形態(tài)觀察：細(xì)胞質(zhì)均勻、沒有空泡 固定染色法 ：0.1%透明質(zhì)酸酶 醋酸酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h48h 1%間苯二酚蘭（Lacmoid）或1%地衣紅（Orcein）的40%醋酸溶液染色 受精和胚胎發(fā)育潛能的評(píng)定 第19頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟影響卵母細(xì)胞成熟的因素 卵母細(xì)胞的來

13、源：不同種類的動(dòng)物、不同生理階段的動(dòng)物(小牛低于成年牛)、卵母細(xì)胞的質(zhì)量等；（1）動(dòng)物種類與年齡： 牛、羊效果較好，而馬、豬較差。 小牛卵母細(xì)胞的平均直徑（118.041.15m）比成年母牛的（122.840.74m）小。 體外成熟的小牛卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育潛力也低于成年卵母細(xì)胞第20頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟（2）卵母細(xì)胞的形態(tài) A、 76.2%； B、67%； C、22%； D、11.4% （3）卵巢貯存時(shí)間與溫度 30C 對(duì)成熟和胚胎發(fā)育不利(First & Parrish） 綿羊的卵巢貯存在22C數(shù)小時(shí)對(duì)成熟無明顯

14、影響，但體溫條件下則會(huì)使卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降 (Moodie & Graham )第21頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟2. 激素 目前大多數(shù)都離不開FSH或LH或兩者的混合物，但仍有爭(zhēng)議 GH能顯著提高精子的受精率，促進(jìn)卵裂及胚泡的形成 甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP） 胰島素 激活素 第22頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟3. 生長(zhǎng)因子 目前已經(jīng)證實(shí)與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)的生長(zhǎng)因子有：上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和（TGF-，）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF

15、）、胰島素類生長(zhǎng)因子和（IGF-，）4. 血清 胎牛血清（FBS）、發(fā)情牛血清（OCS）、發(fā)情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清（SCS）、公牛血清（SS）。 第23頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外保存1. 37保存 應(yīng)考慮保存時(shí)間與卵老化 2.低溫保存 0-10 兔:10，受精能力顯著降低。 第24頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外保存 3. 冷凍保存 借鑒胚胎冷凍方法，現(xiàn)已建立了幾種卵母細(xì)胞冷凍程序 ： A 慢速冷凍、慢速解凍法 B 慢速冷凍、快速解凍法 C 快速冷凍、快

16、速解凍法 D 一步冷凍法 E 玻璃化法 F 超快速冷凍法 第25頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)影響卵母細(xì)胞成熟的因素培養(yǎng)條件： 溫度：37C較好，但各種動(dòng)物最適溫度不同，如兔子低于體溫3C較好，牛35-39C都可，但38-39C最合適； 培養(yǎng)基：水、血清（無血清、有血清)、 無血清時(shí)添加BSA等；有血清時(shí)如胎牛血清、發(fā)情牛血清、公牛血清、超排牛血清等；第26頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離與洗滌洗滌的目的：去掉精漿中抑制精子獲能的因子和死精子，或洗去防凍劑及卵黃等成分，以獲得活力好的精子。

17、精子分離及洗滌方法 懸浮法(Swim-up)：利用精子上游的特性將高活力的精子與死精子及精漿成分分開。 將精液置于獲能液或受精液中，培養(yǎng)箱中孵育齡10-30分鐘，吸取上層液體，再離心洗滌1-2次即可。精子的分離、洗滌與體外獲能第27頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能 離心洗滌法：對(duì)于活力好的精子直接將其放入獲能液或受精液中，離心洗滌若干次便可。 BSA/Percoll密度梯度離心法：利用形態(tài)正常精子密度高于異常精子的原理。如將BSA制成不連續(xù)的密度梯度或?qū)ercoll制成30-40%或45-90%梯度，經(jīng)平衡離心從而得到高

18、受精力的精子。 玻璃棉過濾法：采作小玻璃珠過濾除去死精子。因其成本高，較少采用。第28頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（二）精子獲能處理方法 1. 血清白蛋白法 將精子與血清白蛋白溶液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間孵育 。 該法由于需要的時(shí)間較長(zhǎng)，且誘發(fā)精子獲能的作用不強(qiáng)，故僅在IVF技術(shù)研究的初期進(jìn)行過嘗試，具有一定作用，目前僅作為精子獲能的一種輔助手段。2. 高滲鹽法 精子表面含有許多被膜蛋白，即所謂的“去能因子”。當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時(shí)，這些被膜蛋白將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。 由于高離子強(qiáng)度溶液對(duì)精子具有滲透打擊作用，會(huì)影響精子的活力，故目前已廢除不用。 第29頁

19、，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（二）精子獲能處理方法3.卵泡液孵育法 卵泡液含有來自血清的大分子物質(zhì)，并含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應(yīng)的因子，故在精液中添加一定濃度的卵泡液可誘發(fā)精子獲能。 10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3% Vs 87.5%）和囊胚發(fā)育率（8.3% Vs 40.4%）均顯著下降，但加入50%的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞條件液則能 。 卵泡液可以用于精子的獲能處理，但不能用于IVF系統(tǒng)。第30頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（二）精子獲能處理方法4. 鈣離子載體法 鈣離子載體A23187能直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+

20、濃度，從而導(dǎo)致獲能。 0.5mol/L1.0mol/L A23187溶液處理精子5 min，然后加入等量含1% BSA的BO溶液終止A23187的作用，即可將獲能精子加到含卵母細(xì)胞的受精滴中進(jìn)行IVF。 注意控制A23187的工作濃度和作用時(shí)間，否則會(huì)導(dǎo)致精子的活力下降和死亡。 第31頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（二）精子獲能處理方法 5. 肝素法 肝素是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子獲能。 最初，制備好的精子常用含有肝素（100mg/L）的獲能液預(yù)處理15 min，然后加到受精滴中進(jìn)行IVF。 現(xiàn)直接將肝

21、素（50mg/L）添加到受精液中進(jìn)行受精。 第32頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（三）精子獲能的檢測(cè) 1. 精子形態(tài)及運(yùn)動(dòng)方式的觀察 頭部膨大，活力增強(qiáng)，超活化 2. 頂體反應(yīng)的檢測(cè) （1）雙重染色法 優(yōu)點(diǎn)：無需昂貴設(shè)備，簡(jiǎn)單易行； 缺點(diǎn)：易發(fā)生誤判 （2）透射電鏡觀察 成本高，制片繁瑣，可操作性不強(qiáng)。 第33頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四三、IVF培養(yǎng)系統(tǒng) （一）微滴系統(tǒng) 20-40l微滴受精液，覆石蠟油，每滴放入IVM的卵母細(xì)胞10-20枚及獲能處理的精子（1.0-1.5）106個(gè)/ml，孵育6 -24 h 優(yōu)點(diǎn)：受精液及精液的用量均

22、較少，IVF的效果亦較好； 缺點(diǎn)：結(jié)果易受石蠟油質(zhì)量影響，操作繁瑣，成本較高。 第34頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四 （二）四孔培養(yǎng)板系統(tǒng) 每孔加入500ml受精液和100-150枚IVM的卵母細(xì)胞，然后加入獲能處理的精子（1.0-1.5）106個(gè)/ml，孵育6h-24h。 優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，受精結(jié)果不受石蠟油質(zhì)量的影響； 缺點(diǎn)：精子的利用率相對(duì)較低，IVF效果不如微滴法穩(wěn)定。 三、IVF培養(yǎng)系統(tǒng) 第35頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四 通常以精子穿透率、原核形成率、受精分裂率和囊胚發(fā)育率來衡量。其中，囊胚發(fā)育率最為可靠。 （一）固定

23、染色法 受精810h 精子穿透率和多精子受精率；受精1820h 雙原核形成率（二）體外培養(yǎng) 受精48h 2-8細(xì)胞比例，7d 囊胚發(fā)育率，9d 囊胚的孵化率 三、IVF質(zhì)量評(píng)定第36頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能 Sperm Swim-upIt is slower than the Percoll procedure, sometimes it does not give better results. 1. Thaw 6 to 8 straws of frozen semen in the cyto-thaw for

24、60 seconds. If possible, use semen from different bulls. 2. Combine contents of straws in 5 ml Sp-TALP. Place sample into the incubator (38.5C) for 5 minutes. 3. Centrifuge semen (200 x g; 5 min) and discard all but the bottom 1 ml of supernatant. 4. Prepare 4 to 5 test tubes containing 1 ml Sp-TALP

25、. Add approximately 250 ml of sperm suspension very slowly to the bottom of each tube using a 20 gauge needle and 1 ml syringe. Place tubes in incubator (38.5C) for 1 h. 5 At the end of sperm swim-up, aspirate the top 800 ml from each tube and combine samples. Centrifuge (1000 rpm) the combined samp

26、le for 5 minutes. Discard all but the bottom 500 ml of supernate. 第37頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能 Glass- wool FiltrationThis filtration procedure usually requires 10-15 minutes and generally yields nearly 100% viable sperm. 1. Prepare in advance 0.2 ml glass wool columns in 1

27、 ml syringes that are rinsed 10X with Milli-Q water and autoclaved. 2. Immediately before starting purification, rinse column several times with Hepes-TALP and finally with Sperm-TALP to equilibrate column. 3. Frozen-thawed semen (3-5 straws) is washed twice with 10-15 ml Sperm-TALP by centrifugatio

28、n at 200 x g (10 min) and then resuspended in 0.6-0.8 ml IVF-TALP. 4. Sperm suspension is then layered over the wet column and allowed to filter by gravity. 5. The number and viability of filtered sperm is determined. 第38頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能第39頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26

29、分，星期四 Thaw strawLayering of sperm onto Percoll. After cutting the tip of the straw (Left panel), the contents of the straw are expelled onto the top of the Percoll gradient (right panel). Here, removal of the semen is facilitated by using a homemade plunger. Percoll gradient: up to bottom45-90%第40頁，

30、共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Removal of sperm from the bottom of the Percoll gradient. Washing sperm in Sp-TALP. The left panel shows the washed and centrifuged sperm. The right panel shows the pellet of sperm remaining in the tube after aspiration of the supernatant. Percoll method第41頁，共71頁，2022年，5月2

31、0日，19點(diǎn)26分，星期四Hemacytometer used for counting sperm. 第42頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能2.精子的體外獲能(1)卵泡液孵育法：卵泡液含有來自血清的大分子物質(zhì)，并含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應(yīng)的因子，故在精液中添加一定濃度的卵泡液可使精子獲能。但不能用于體外受精(卵裂率和囊胚率下降)。(2)鈣離子載體法：鈣離子載體A23187能誘發(fā)Ca進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)精子的超活化和頂體反應(yīng)，從而導(dǎo)致獲能。但其作用時(shí)間和濃度對(duì)于獲能非常關(guān)鍵。第43頁，共71頁，2022年，5月20日，19

32、點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能(3)肝素法：它與精子孵育后，能引起Ca進(jìn)入精子內(nèi)，導(dǎo)致獲能。這是被廣泛采用的獲能法。原來將肝素(100mg/ml)獲能液預(yù)處理精液，再受精，現(xiàn)在直接將肝素(50mg/ml)添加到受精液中受精。 實(shí)際操作時(shí)，常將多種因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系統(tǒng)。第44頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能3. 精子獲能的檢測(cè)(1)精子形態(tài)及運(yùn)動(dòng)方式改變(常用)： 獲能后的精子頭部膨大，運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。(2)頂體反應(yīng)的檢測(cè)： 雙重染色法：取樣固定染色(快綠FCF和曙紅)涂片干燥觀

33、察若頭部有厚的藍(lán)綠區(qū)為無獲能，若出現(xiàn)粉經(jīng)為獲能。 電鏡法：第45頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四2. 體外授精 授精通常在覆蓋下的微滴中進(jìn)行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10個(gè)卵母細(xì)胞，精子最終濃度為1X106個(gè)/ML。培養(yǎng)條件：5%CO2、39C培養(yǎng)，BO液中6-8h，TALP液中18-24h。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的體外獲能與體外受精(牛)第46頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四1. Remove plates containing matured oocytes from the incubator and place on

34、 the slide warmer. 2. Add 25 ml sperm preparation and 25 ml PHE mix into each well. When pipetting the sperm, place the pipette in the middle of the sperm suspension rather than on the bottom to avoid grabbing debris that can settle to the bottom of the tube. 3. Return 4-well plate to incubator for

35、8-10 h. Many people do fertilization for 18-20 h. When we were establishing IVF in our lab, 8-10 h gave better results than longer incubation times. Recently, however, we have gotten good results with 18-20 h fertilization times. In addition, longer fertilization times make it easier to remove cumul

36、us cells after fertilization. To determine the incidence of parthenogenesis, one well should be prepared without sperm, but with PHE. After 8 10 h, place these oocytes into a separate culture medium drop and culture for 2 days before looking at rate of parthenogenesis. 體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)體外受精第47頁，共71頁，2022年，

37、5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育阻滯期： 各種動(dòng)物的早期胚胎體外發(fā)育時(shí)都存在阻斷期，因此可通過改善培養(yǎng)條件和在培養(yǎng)液中添加生長(zhǎng)因子(TGF-或bFGF等)或細(xì)胞外基質(zhì)因子克服阻斷。但目前的發(fā)育率仍然比較低，約為40%，是限制體外受精應(yīng)用的一個(gè)突出問題。各種動(dòng)物阻斷期： 牛： 豬： 羊： 第48頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育 培養(yǎng)液添加的成分：(1)丙酮酸鈉和乳酸鈉：作為能量底物。(2)生物體液和蛋白質(zhì)：FCS、NCS、發(fā)情母畜血清、BSA等。(3)激素：PMSG、FSH、胰島素、雌激素等，提

38、高囊胚率。(4)生長(zhǎng)因子及多肽：IGF，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、受精和早期胚胎發(fā)育；EGF促進(jìn)胚胎的分化和囊胚的形成；TGF促使牛的胚胎通過早期阻斷；LIF(白血病抑制因子)提高孵化囊胚發(fā)育率，并抑制胚胎干細(xì)胞的體外分化。第49頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育 2. 胚胎的體外培養(yǎng)系統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)：微滴法和培養(yǎng)板法。輸卵管離體培養(yǎng)法：克服阻斷，但因繁瑣不常用。與體細(xì)胞共培養(yǎng)：如輸卵管上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等。第50頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)胚胎的冷凍保存常規(guī)的慢

39、速冷凍法冷凍液: 1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP 1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP冷凍方法： 在室溫下，先將牛胚胎放入防凍液中平衡一段時(shí)間； 裝管； 以每分鐘1的速度降溫至7； 植冰； 以每分鐘0.5的速度降溫至35；平衡10分鐘后，投入液氮中保存。第51頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)胚胎冷凍保存2. 玻璃化冷凍冷凍液： EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷凍步驟： 首先將胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min； 用移卵管移入玻璃化溶液中

40、平衡10min； 裝管，封口； 將細(xì)管投入液氮冷凍保存。第52頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四影響體外受精的因素卵母細(xì)胞的成熟精子的體外獲能第53頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（一）卵母細(xì)胞的成熟度第54頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四（二）精子體外獲能第55頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四 （三）公畜的影響第56頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Some instruments used to pick up embryos and oocytes. From l

41、eft to right are a 1 cc syringe with an extension of rubber tubing connected to a Unopette, a wiretrol (from Drummond Scientific), the same device as #1 without the rubber tubing extension and a 5 ml Drummond Microdispenser. 第57頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Use of the wiretrol using two hands (left p

42、anel) or one hand (right panel). 第58頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Two methods for using the Unopette tip. The device on the left panel has been modified to include a piece of rubber tubing between the Unopette and syringe to give the technician greater control over the volume aspirated. 第59頁，共71頁，202

43、2年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四 (A) On a Petri-dish (i.e. Intergrid plate) place 3 microdrops of 70 l holding medium side by side. (B) Place one blastocyst into the middle drop(C(C-D) Insert the cotton plug side of a 0.25 ml French straw into the wide end of the pipet tip. D( (E) Aspirate one empty drop.A (E) A

44、spirate air to create a 0.5 cm columnA (F) Aspirate the microdrop containing embryo (make sure that the embryo is aspirated by observing under the microscope; A (F) Aspirate air to create a 0.5 cm columnh (G) Aspirate the remaining empty drop until the cotton plug is wet.R (H) Remove transfer straw

45、from syringe and place on slide warmer until use.第60頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Who should be treated with in vitro fertilization? In vitro fertilization can be used as an effective treatment for infertility of all causes except for women with infertility caused by an anatomic problem with the uter

46、us, such as severe intrauterine adhesions. It is generally used in couples who have failed to conceive after at least one year of trying who also have one or more of the following:1. Blocked fallopian tubes or pelvic adhesions with distorted pelvic anatomy. Women that have had tubal ligation and are

47、 considering tubal reversal surgery as well as men that are considering vasectomy reversal surgery might also consider IVF.2. Severe male factor infertility (low sperm count or low motility)3. Failed 2-6 cycles of ovarian stimulation with intrauterine insemination第61頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四Who

48、should be treated with in vitro fertilization?4. Advanced female age - over 385. Reduced ovarian reserve, which means lower quantity (and sometimes quantity) of eggs. A day 3 FSH and estradiol test and antral follicle counts are often done as screening tests for egg quantity (and quality). Reduced e

49、gg quantity and quality is usually treated with either IVF, or with IVF using egg donation from another woman.6. Severe endometriosis第62頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四 The graph shows live birth rates for all 23 reporting Illinois IVF centers for 2002 These clinics reported live birth rates ranging fr

50、om 13.5% to 47.4% per egg retrieval for women under 35 Five Illinois IVF programs failed to report their outcome data to the government (US law requires reporting annually)第63頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四How is in vitro fertilization performed?1. Basic screening tests are performed on both partners

51、at all IVF clinics.In general, some testing of ovarian reserve should be done on the female prior to starting the injections. We use day 3 FSH testing as well as antral follicle counts for this purpose. The results of these tests give us some ability to predict whether her ovaries will respond well

52、to the drugs (make sufficient follicles and eggs). The number of eggs retrieved correlates strongly with IVF success rates.2. Consents are signed by all parties.3. The woman is stimulated with injected medications to develop multiple egg development. These injections continue for about 8 - 10 days.第

53、64頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四How is in vitro fertilization performed?4. Blood and ultrasound testing is done every 1-3 days to monitor the development of the follicles (egg-containing structures) in the ovaries.We need to get a minimum number of 3 follicles to develop to maturity in order to be ab

54、le to proceed with the egg retrieval. About 90% of women under 40 with a normal FSH and normal antral follicle counts will develop at least this minimum number of follicles. If this many mature follicles can not be obtained from the stimulation process - we will cancel the cycle (not proceed to egg

55、retrieval).第65頁，共71頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)26分，星期四How is in vitro fertilization performed?5. When the womans follicles are mature, a transvaginal ultrasound-guided egg retrieval (egg aspiration) procedure is performed to remove the eggs from the follicles. The average duration of this procedure is 5-6 minu

56、tes (at our facility).6. The embryos are cultured in the laboratory for 2-6 days.7. The embryo transfer procedure is done which places the embryos in the womans uterus where they will hopefully implant and develop to result in a live birth. This is like a Pap smear for the woman. There should be no discomfort.8. If there are leftover embryos (of sufficient quality) beyond the number that is transferred, many couples prefer to have them frozen (cryopreserved) for use in a future cycle.Embryo cryopreservation can be used for another attempt at h