基因治療醫(yī)學知識培訓培訓課件

1、基因治療醫(yī)學知識培訓基因治療醫(yī)學知識培訓1995年，康乃爾大學的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因時，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達的增強。但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋正好相反的。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋。直到1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學醫(yī)學院的Craig Mello才首次揭開這個懸疑之謎。通過大量艱

2、苦的工作，他們證實，Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡稱RNAi)。在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在

3、被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視?；蛑委熱t(yī)學知識培訓21995年，康乃爾大學的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿2000年，RNA的研究進展被美國科學雜志評為重大科技突破；2001年“RNA干擾”作為當年最重要的科學研究成果之一，再次入選“十大科技突破”；2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時， Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性進展，是生物醫(yī)學領域近

4、20年來，可與HGP（人類基因組計劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一。 基因治療醫(yī)學知識培訓32000年，RNA的研究進展被美國科學雜志評為重大科技突三、基因干預 Gene Interference基因治療醫(yī)學知識培訓4三、基因干預 Gene Interference基因治療醫(yī)學基因干預的種類：1.反義RNA (antisense RNA)2.干擾RNA (RNA interference)3.核酶 (ribozyme)基因治療醫(yī)學知識培訓5基因干預的種類：1.反義RNA (antisense RNA反義RNA: 與靶核酸（如mRNA或有義DNA）鏈互補的RNA分子，可抑制核酸的功能反

5、義RNA，根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為3類：類反義RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶 降解；類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結合，引起mRNA構象變化，抑制翻譯；類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉錄。基因治療醫(yī)學知識培訓6反義RNA: 與靶核酸（如mRNA或有義DNA）鏈互補的RN （一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達調(diào)控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構建能轉錄反義R

6、NA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉入細胞，轉錄出反義RNA而發(fā)揮作用。基因治療醫(yī)學知識培訓7 （一）反義RNA基因治療醫(yī)學知識培訓 反義RNA的關鍵技術問題：反義RNA進入靶細胞前的降解問題專一性轉移問題： 基因治療醫(yī)學知識培訓8 反義RNA的關鍵技術問題：反義RNA進入靶細胞2.受體介導反義RNA技轉移術 受體介導的RNA轉移十分專一，而且效率高；被轉移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。 將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝

7、細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。 借助受體介導DNA轉移方法把DNA換成反義RNA，就可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA的轉移?；蛑委熱t(yī)學知識培訓92.受體介導反義RNA技轉移術 受體介導的RNA轉移十分 3. 反義RNA的應用前景 受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉基因治療的不足。 （l）安全性高 （2）反義RNA設計和制備方便 （3）具有劑量調(diào)節(jié)效應 （4）能直接作用于一些RNA病毒 反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結構。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細胞內(nèi)部被降解，

8、不留“殘渣”。 在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖?；蛑委熱t(yī)學知識培訓10 3. 反義RNA的應用前景 受體介導的反義RNA（二）干擾RNA 實驗結果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率

9、比反義RNA至少高2個數(shù)量級。1.RNA干擾現(xiàn)象 RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。 對RNA干擾的認識來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進行的實驗。/nrg/journal/v2/n2/animation/nrg0201_110a_swf_MEDIA1.html/RNAi.htm基因治療醫(yī)學知識培訓11（二）干擾RNA 實驗結果顯示，有義鏈RNA（se 2.RNA干擾的機制 RNA干擾過程主要有2個步驟： （1）小干擾性RNA（siR

10、NA）（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。 該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。 長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）?；蛑委熱t(yī)學知識培訓12 2.RNA干擾的機制RNA干擾過程主要有2個步驟：（1）小A. 賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結構； RNA干擾機制示意圖 基因治療醫(yī)學知識培訓13A. 賈第鞭毛蟲

11、Dicer的晶體結構； RNA干擾機制示意圖 1. 體外化學合成; 2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生基因治療醫(yī)學知識培訓14 1. 體外化學合成; 2. 用3.RNA干擾的應用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛領域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學、生物學領域的應用有著廣闊的前景。基因治療醫(yī)學知識培訓153.RNA干擾的應用前景基因治療醫(yī)學知識培訓15（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技術具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具

12、。 RNA干擾技術能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應。 基因治療醫(yī)學知識培訓16（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技 （2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義RNA技術誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNA干擾技術可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型，也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。RNA干擾技術可用于治療有異?；虮磉_的惡性腫瘤。

13、K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關，用RNA干擾技術可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。 通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達，能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。 應用RNA干擾技術成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因Sp1的功能?！俺聊闭娴氖墙?基因治療醫(yī)學知識培訓17 （2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義RNA技術誘 （3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）

14、某些基因的表達，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細胞內(nèi)復制。用RNA干擾技術抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細胞內(nèi)表達，可阻礙HIV感染細胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細胞內(nèi)復制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。“沉默”真的是金 基因治療醫(yī)學知識培訓18 （3） 病毒性疾病的基因治療 “沉默”真的是金 基 siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的病毒性疾病的防治具有十分重大

15、的意義?；蛑委熱t(yī)學知識培訓19 siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學知識培訓20siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學知識培訓21siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學T. Cech S. Altman 1989年，核酶的發(fā)現(xiàn)者T.Cech和S. Altman被授予 諾貝爾化學獎。 （三）核酶(ribozyme) 核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子 基因治療醫(yī)學知識培訓22T. Cech S. Altman 1

16、989年，核酶的發(fā)現(xiàn)者（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。 在基因治療時，利用核酶分子結合到靶RNA分子中適當?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結構，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。 只要兩個RNA分子通過互補序列相結合，形成錘頭狀的二級結構（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應?；蛑委熱t(yī)學知識培訓23（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多為 1. 核酶的設計 核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結

17、構域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設計核酶。 （1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結合并組成酶活性結構域。 （2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結構域），兩端是引導序列。 在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點，設計和合成特定的核酶。設計的基本原則是核酶分子與靶部位結合后能形成酶活性結構域。 基因治療醫(yī)學知識培訓24 1. 核酶的設計 核酶是通過靶RNA分子與核酶分核酶的作用機制 基因治療醫(yī)學知識培訓25核酶的作用機制 基因治療醫(yī)學知識培訓25 2.核酶的應用 與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結

18、構，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合和切割其它的mRNA分子。 基因治療醫(yī)學知識培訓26 2.核酶的應用 與一般的反義RNA相比，核四、治療基因的受控表達 Regulated Expression of Therapeutic Gene基因治療醫(yī)學知識培訓27四、治療基因的受控表達 Regulated Expressi 時間: 要實現(xiàn)治療基因的受控表達，必須建立完善的基因表達調(diào)控體系?；蛘{(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機制、基因外部調(diào)節(jié)機制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達以及治療基因的誘導表達等。 治療基因的受控表達包括控制治

19、療基因表達的時間、空間和水平三個方面。 空間:表達水平：希望治療基因能在一個適當?shù)乃奖磉_。 1.控制治療的基因在患者需要實施治療時才表達，而平時不需要進行治療時則處于關閉狀態(tài)； 2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達的時間跨度。 是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴格限制治療基因只在靶細胞中表達，避免治療基因指導合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。 基因治療醫(yī)學知識培訓28 時間: 要實現(xiàn)治療基因的受控表達，必須建立（一）基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件基因治療醫(yī)學知識培訓29（一）基因內(nèi)部的調(diào)

20、節(jié)機制基因治療醫(yī)學知識培訓29 1.使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件 例如，酪氨酸酶是皮膚細胞和黑色素瘤細胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動子驅(qū)動治療基因只在黑色素瘤細胞中表達，而不在正常的周邊細胞中表達。 不同類型的正常細胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達調(diào)控元件可用于驅(qū)動治療基因的特異性表達，從而起到治療作用。 前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動治療基因在PSA陽性的前列腺癌細胞中表達而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細胞和非前列腺癌細胞

21、中不能使治療基因表達?；蛑委熱t(yī)學知識培訓30 1.使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件例如，酪氨酸 2.使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件 某些病變的細胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達調(diào)節(jié)元件也可以用來控制治療基因的特異性表達。 甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細胞中表達，不在成年肝臟細胞中表達。肝細胞腺癌細胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動子驅(qū)動治療基因(如自殺基因)在癌細胞中表達，使癌細胞經(jīng)給藥后被殺死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細胞中表達很高，采用其啟動子可以使治療基因只在CEA陽性的癌細胞中表達，而不會在陰性細胞中表

22、達。基因治療醫(yī)學知識培訓31 2.使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件 （二）基因外部的調(diào)節(jié)機制 除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制以外，還可通過施加外部刺激，促進治療基因在特定細胞或組織中表達。 采用熱休克蛋白基因的表達調(diào)控元件來啟動治療基因，可以通過對病灶局部進行熱處理，達到使治療基因特異性表達的目的。 Egr-1基因是一種編碼鋅指轉錄因子的早期基因，包括電離輻射和細胞因子等在內(nèi)的多種外部刺激都可以誘導其表達，將其調(diào)控序列啟動的治療基因(如腫瘤壞死因子基因)導入腫瘤組織，可在電離輻射等作用下，使治療基因獲得暫時性的局部表達，殺死腫瘤細胞。 組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中

23、風和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達調(diào)控元件中存在受輻射誘導的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動治療基因的表達，增強放療效果。 基因治療醫(yī)學知識培訓32（二）基因外部的調(diào)節(jié)機制 除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達 病灶微環(huán)境與正常時往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達。 例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細胞能夠抵御應激。當采用這種基因的啟動子來控制治療基因時，可以使治療基因在腫瘤細胞中表達，使腫瘤組織壞死。 腫瘤細胞生長速度快于形成血管的

24、內(nèi)皮細胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏的區(qū)域。缺氧條件可以通過缺氧誘導因子(HIF-1)和缺氧響應元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達；如果采用缺氧響應元件(HRE)來控制治療基因的表達，即可實現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達，而在正常組織中不表達。 機體發(fā)炎時所可產(chǎn)生的許多急性期蛋白，其基因的啟動子可以控制發(fā)炎條件下治療基因的表達；而一旦炎癥消失，治療基因的表達也隨之終止?；蛑委熱t(yī)學知識培訓33（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達 病灶微（四）治療基因的誘導表達 采用組織特異性啟動子控制治療基因的表達，可能造成這些基因在靶細胞中表達，不再受外界控制。為了

25、避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導性基因表達系統(tǒng)。 這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉錄激活劑，它只在誘導藥物存在時才能與DNA結合；另一種則是特異性基因表達調(diào)控元件，僅對這種轉錄激活劑有所響應。 基因治療醫(yī)學知識培訓34（四）治療基因的誘導表達基因治療醫(yī)學知識培訓34四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因的轉錄受Tet阻遏蛋白的負調(diào)控。無四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達；四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉錄得以進行。 基因治療醫(yī)學知識培訓35四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)

26、素抗性基因的轉錄受Tet阻遏蛋白五、基因治療的應用研究The Application of Gene Therapy基因治療醫(yī)學知識培訓36五、基因治療的應用研究The Application of 世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗?；蛑委熱t(yī)學知識培訓37 基因治療醫(yī)學知識培訓37（一）遺傳病的基因治療研究 已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為4050。但真正了解病因，能進行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。

27、 1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞(如皮膚細胞，骨髓細胞等)中表達并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：基因治療醫(yī)學知識培訓38（一）遺傳病的基因治療研究 已知人類有4000多種1腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏癥 2珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病 3血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 4苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 5萊-納(Les

28、ch-Nyhan)綜合征 6家族性高膽固醇血癥 7囊性纖維化病 基因治療醫(yī)學知識培訓391腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 基因治療醫(yī)學知（二）惡性腫瘤基因治療研究 （1）通過基因置換和基因補充，導入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉移； 腫瘤發(fā)生是一個極為復雜的過程，許多基因的突變會導致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應；（4）通過導入“自殺基因”殺傷癌細胞?；蛑委熱t(yī)學知識培訓40（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過基因置換和基因補充

29、，導入 1.腫瘤基因治療的基本策略 從實際應用于臨床治療的角度來看，腫瘤基因治療的策略包括： (1)直接殺傷腫瘤細胞或抑制其生長。 (2)增強機體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細胞。 (3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。基因治療醫(yī)學知識培訓41 1.腫瘤基因治療的基本策略 基因治療醫(yī)學知識培訓41 2.腫瘤基因治療的常用方法 基因干預技術：通過基因干預，使得腫瘤細胞過度表達的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。 自殺基因治療分子化療：直接殺死腫瘤細胞。 腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能。 提高化療效果的輔助基因治療： 藥物增敏基因治療； 耐藥基因治療。 基因治療

30、醫(yī)學知識培訓42 2.腫瘤基因治療的常用方法基因治療醫(yī)學知識培訓42 3.自殺基因治療：自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領域中的研究熱點之一。 基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導入某些真核細胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前體，轉變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚目勾x藥物，進而選擇性地將轉染了該基因的腫瘤細胞“自殺”。這些基因也相應地被稱為“自殺基因”?；蛑委熱t(yī)學知識培訓43 3.自殺基因治療：自殺基因治療是目前腫瘤基因治 自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤細胞中，而不傷及正常細胞。 利用免疫脂質(zhì)體、受體介導等技術進行定向基因轉移。

31、利用病毒載體進行基因轉移。腫瘤特異性基因轉錄。腫瘤內(nèi)直接注射。 自殺基因轉移常用方法基因治療醫(yī)學知識培訓44 自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局基因治療醫(yī)學知識培訓培訓課件5.提高化療效果的輔助基因治療： 臨床上對腫瘤患者進行化療時，通常面臨兩大難題：（1）是患者機體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導致化療失敗。（2）是大劑量的化療可能導致患者的正常細胞，特別是骨髓造血細胞的功能受到抑制。 基因治療醫(yī)學知識培訓465.提高化療效果的輔助基因治療： 臨床上對腫瘤患者進行 (

32、1)藥物增敏基因治療： 將雞鈣調(diào)素（calmodulin, CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘毎闏127，結果僅需低劑量的長春新堿或長春花堿即可明顯抑制該細胞株的生長。對其作用原理進行研究后發(fā)現(xiàn)，CaM基因的表達產(chǎn)物作為細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增加了腫瘤細胞對長春新堿或長春花堿的吸收量而相應減少了排出量，從而提高了腫瘤細胞內(nèi)化療藥物濃度，導致腫瘤細胞死亡。 為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細胞，特別是對化療藥物原本不敏感的腫瘤細胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達到增強化療效果的目的。 基因治療醫(yī)學知識培訓47 (1)藥物增敏基因治療：

33、 將雞鈣調(diào)素（ (2)耐藥基因治療： 在解決化療所致骨髓細胞造血功能受到嚴重抑制的問題方面，通過向腫瘤患者的骨髓細胞導入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強骨髓細胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達到徹底殺滅腫瘤細胞的目的。 腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生與多種糖蛋白或酶有關，包括多藥耐藥（mdr-1）基因編碼的P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白（MRP）以及近年來發(fā)現(xiàn)的肺耐藥相關蛋白等；還有細胞內(nèi)氧化和解毒作用的酶系統(tǒng)，包括細胞色素P-450（cytochrome P-450）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等等。 目前除了開發(fā)針對腫瘤細胞耐藥性產(chǎn)生機制的拮抗劑

34、，如用于阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成的丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。還采用基因干擾技術，在基因水平阻斷耐藥基因的表達，使腫瘤細胞喪失多藥耐藥性，從而易于被化療藥物殺死。 基因治療醫(yī)學知識培訓48 (2)耐藥基因治療： 在解決化（三）病毒性疾病的基因治療研究 據(jù)統(tǒng)計，75%的人類傳染病是由病毒引起的。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長期潛伏，造成終身傷害。病毒還是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的聯(lián)系。迄今為止，臨床上對絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，而在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。