單基因遺傳病研究方法和技術(shù)

1、關(guān)于單基因遺傳病的研究方法與技術(shù)第1頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四已知致病基因突變分析第2頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四基因突變第3頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四基因突變穩(wěn)定突變：傳遞中不改變?cè)械耐蛔?。?dòng)態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見(jiàn)于短重復(fù)序列的突變，在一代代傳遞中重復(fù)次數(shù)發(fā)生明顯變化。 第4頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四三核苷酸重復(fù)突變第5頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四基因突變類(lèi)型點(diǎn)突變：只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，是突變中最多見(jiàn)的形式。突變的結(jié)果分為： 同

2、義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、剪切突變等。堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個(gè)或幾個(gè)堿基，其結(jié)果是突變點(diǎn)下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱(chēng)移碼突變（frameshift mutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼。第6頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四基因突變類(lèi)型框內(nèi)突變（inframe mutation）：3個(gè)或是3的倍數(shù)的堿基缺失或插入導(dǎo)致的突變，使基因丟失或增加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸。DNA大片段缺失或復(fù)制（large deletion or duplication)：幾百個(gè)bp至幾十個(gè)kb的堿基缺失或復(fù)制。 第7頁(yè)，共74頁(yè)，2022

3、年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四各種類(lèi)型病理性突變的比例無(wú)義突變和移碼突變： 60稀有的錯(cuò)義突變： 20DNA大片段缺失或重復(fù): 20微小突變第8頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四基因突變分析所用實(shí)驗(yàn)材料臨床樣本取材：外周血組織毛囊頰粘膜脫落細(xì)胞羊水細(xì)胞絨毛實(shí)驗(yàn)應(yīng)用材料：DNARNAProtein第9頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四RNA 的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 不包含內(nèi)含子 RT-PCR 能夠檢測(cè)異常的剪切體缺點(diǎn): 不易獲得 要求操作特別小心且快速以免降解目的基因可能不在獲得的材料組織中表達(dá) 導(dǎo)致RNA不穩(wěn)定的突變不能被檢測(cè)第10頁(yè)，共74頁(yè)，20

4、22年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第11頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第12頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分子雜交基因突變分析常用技術(shù)第13頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四Southern印跡雜交第14頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四例如：脆X綜合征若X染色體在Xq27.3處呈現(xiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)，且連接的末端形似隨體，這條染色體就被稱(chēng)為脆性X染色體。主要臨床癥狀：智力低下、語(yǔ)言障礙、性格孤僻、伴有特殊面容長(zhǎng)臉、方額、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可見(jiàn)明顯大于正常的睪丸。通貫掌、三叉點(diǎn)C缺

5、如。第15頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四Xq27.3第16頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四前突變和全突變正常 CGG 200第17頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四Southern雜交法診斷Fragile XF: Fully expanded and methylatedNM: Methylated X do not cut with EclXIP: Unmethylated premutationN: X in normal male and active normal female第18頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月2

6、0日，6點(diǎn)48分，星期四Mullis Ffor his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國(guó)Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點(diǎn)突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開(kāi)創(chuàng)了嶄新時(shí)代。第19頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng) 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性 靈敏度高 指數(shù)增長(zhǎng)，從pg (10-12)可擴(kuò)增至 mg (10-6)水平 簡(jiǎn)便、快速 24 小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)

7、標(biāo)本的純度要求低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板 第20頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）: 40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程第21頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四5533d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5353535353535353添加反應(yīng)混合液及樣本變性535353535353退

8、火加入試管中第22頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四延伸53535353繼續(xù)延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循環(huán)第23頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四5353535355335353第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝53535353535353535353533553535353第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝第24頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。第25頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四引物(Prime

9、rs) 引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度化學(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則 第26頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四設(shè)計(jì)引物的原則：二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長(zhǎng)度為18 25個(gè)核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應(yīng)平衡引物的5端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）第27頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四DNA聚合酶Taq DNA聚合酶復(fù)制的保真性：Taq DNA聚合酶無(wú)3 5外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。

10、Taq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。第28頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四擴(kuò)增失敗試劑錯(cuò)加或漏加 實(shí)驗(yàn)中如發(fā)現(xiàn)對(duì)照樣本也擴(kuò)增失敗，可用原試劑重復(fù)一次，以確定試劑是否錯(cuò)加或漏加。試劑失效變性溫度偏低 有些DNA所含G、C堿基對(duì)豐富，當(dāng)變性溫度偏低時(shí)，雙鏈DNA不能完全解鏈。退火溫度偏高 第29頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四標(biāo)本中DNA含量過(guò)高或雜質(zhì)過(guò)多。降低加樣量拖尾可明顯改善。Taq酶加量過(guò)大或擴(kuò)增循環(huán)數(shù)太多拖尾第30頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四非特異條帶退火溫

11、度低,提高退火溫度。引物特異性不佳，切膠純化特異條帶Taq酶加量過(guò)大或擴(kuò)增循環(huán)數(shù)太多第31頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四引物二聚體引物量過(guò)多：降低引物濃度。引物設(shè)計(jì)問(wèn)題操作問(wèn)題：反應(yīng)體系建立后，如在室溫放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起擴(kuò)增后的二聚體加重。第32頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四應(yīng)用PCR相關(guān)技術(shù)進(jìn)行基因突變分析的策略與方法第33頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四策略與方法直接分析法：PCR片段大小分析：片段大小有明顯差異PCR-RFLP：有酶切位點(diǎn)PCR-測(cè)序：確定突變點(diǎn)堿基改變多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）：片段缺失與重

12、復(fù)RT-PCR: 基因大，可取到新鮮材料，且基因在其中有表達(dá)間接分析法：PCR-STR連鎖分析：基因大；在已知致病基因編碼區(qū)未檢測(cè)到突變的家系第34頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四1. 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)是遺傳性共濟(jì)失調(diào)的主要類(lèi)型，包括SCA127。成年期發(fā)病、常染色體顯性遺傳及共濟(jì)失調(diào)等是本病的共同特征，并表現(xiàn)在連續(xù)數(shù)代中發(fā)病年齡提前和病情加重（遺傳早現(xiàn)）。 SCA3是我國(guó)最常見(jiàn)的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)亞型，基因位于14q24.332，含4個(gè)外顯子。CAG突變位于4號(hào)外顯子，患者擴(kuò)增拷貝數(shù)為6189，正常人為1241。 第35頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5

13、月20日，6點(diǎn)48分，星期四 NC F1 F2 F3 F4 F5 PC M應(yīng)用PCR技術(shù)分析一遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（SCA)3型家系NC:正常對(duì)照PC:陽(yáng)性對(duì)照F:家系成員M:Marker結(jié)果：家系成員1、3、4有SCA3致病基因突變;家系成員2、5未檢測(cè)到突變12345第36頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四2. 脊肌萎縮癥 脊肌萎縮癥( Spinal Muscular Atrophy , SMA)系指一類(lèi)由于下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致的進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力和萎縮的一組疾病 ,是兒童和少年常見(jiàn)的致死性常染色體隱性遺傳病之一 ,其隱性致病基因攜帶率在人群中為 1/ 401/ 5

14、0 ,發(fā)病率為1/60001/10000.第37頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)分析脊肌萎縮癥（SMA）致病基因SMNPCR擴(kuò)增SMN基因exon7,DraI酶切PCR產(chǎn)物.酶切N：正常人PCR產(chǎn)物被酶切為兩條帶酶切P：陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物被酶切為一條短帶病人1：結(jié)果顯示SMN基因有突變病人2和3：結(jié)果顯示未有突變第38頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四3. 腓骨肌萎縮癥(CMT)CMT是一類(lèi)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)遺傳病 ,其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD ,占絕大多數(shù)) 、常染色體隱性遺傳(AR)及 X連鎖顯性遺傳(XD)依據(jù)病理

15、和電生理特點(diǎn)分為兩型:脫髓鞘型 (CMT1 型) 和軸突型 (CMT2型). CMT1型約占 CMT總數(shù)的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重復(fù)引起其中X連鎖顯性遺傳CMT致病基因?yàn)镃X32，含有2個(gè)外顯子第39頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四MLPA分析PMP22基因重復(fù)突變第40頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四 PCR-測(cè)序直接分析CX32基因來(lái)診斷X連鎖腓骨肌萎縮癥第41頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四4. 假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良 (DMD) 是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺

16、傳性疾病，在2500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者 致病基因DMD含有79個(gè)外顯子 DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%-70%第42頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四MLPA 技術(shù)簡(jiǎn)介MLPAMultiplex ligation-dependent probe amplification鏈接依賴(lài)型多探針擴(kuò)增技術(shù)最早由荷蘭人Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 在原有PCR技術(shù)上發(fā)展出來(lái)第43頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四MLPA 技術(shù)原理第44頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四ML

17、PA方法檢測(cè)DMD 12345第45頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四5. 成人型多囊腎是一種最常見(jiàn)的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000其主要特征在雙腎形成進(jìn)行性增長(zhǎng)的多個(gè)液性囊腫，最終可引起腎衰竭 具有遺傳異質(zhì)性，存在兩個(gè)主要的致病基因PKD1和PKD246第46頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四47ADPKD分子遺傳基礎(chǔ)GenePKD1PKD2PKD3 ?Chromosomal locus16p13.34q22-23ClonedYesYesPercentage85%15%Exons/Single-copy exons46/Ex35-4615

18、/Ex1-15Mutation number 343100Hot mutation NoNo第47頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PKD1基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性第48頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PKD基因分析:直接基因突變分析： 適于散發(fā)病例和小家系病例。具有結(jié)果判讀的不確定性連鎖分析: 適于分析在已知致病基因編碼區(qū)未檢測(cè)到突變的較大家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例 49第49頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PCR-測(cè)序分析在PKD1外顯子編碼序列上發(fā)現(xiàn)無(wú)義突變，使突變堿基所在密碼子由CGA變?yōu)榻K止密碼子TGA。第50頁(yè)，共

19、74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四連鎖分析結(jié)果第51頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四新致病基因的研究方法和技術(shù)第52頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四家系連鎖分析來(lái)定位: 適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例 二代測(cè)序技術(shù)： 適于散發(fā)病例和小家系病例研究對(duì)象不同，策略方法不同 連鎖分析與二代測(cè)序相結(jié)合加快新基因的發(fā)現(xiàn)第53頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop定

20、位克隆第54頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四 利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。連鎖分析第55頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四DNA STR SNP常見(jiàn)遺傳標(biāo)記第56頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四PCR-STR連鎖分析CACACAPrimer 1Primer 2CACACACACACACACACACACACACACACA第57頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第58頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四毛細(xì)管電泳分

21、析PCR片段大小第59頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四分析D4S1534D4S2929D4S2460D4S423I-1114,124176,178200,202105,112II-1114,120153,159200,202107,109II-2114,124157,176202,204105,112II-3114,122157,178200,202102,105II-4114,124157,176202,204105,112II-5114,124157,176198,202107,109III-1114,124153,176200,202109,112III-2114

22、,124176,176202,202109,112第60頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四連鎖分析結(jié)果第61頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四均勻分布于23對(duì)染色體上的STR SNP芯片通過(guò)全基因組掃描來(lái)定位基因第62頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四外顯子組測(cè)序 用二代測(cè)序技術(shù)尋找致病基因全基因組測(cè)序 第63頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第64頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第65頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第66頁(yè)，共74頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)48分，星期四第67頁(yè)，