標記免疫技術課件

1、基本概念一、免疫標記與標記免疫的概念免疫標記技術：標記物與免疫活性物質的聯(lián)接技術標記免疫技術：以標記免疫物質檢測相應靶物質的技術標記的目的.?基本概念一、免疫標記與標記免疫的概念標記的目的.?二、常用的免疫標記物質類別 標記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 二、常用的免疫標記物質類別 酶標儀酶標儀熒光顯微鏡熒光顯微鏡F

2、CM檢測分析細胞表面受體的表達FCM檢測分析細胞表面受體的表達液閃儀計數(shù)器液閃儀計數(shù)器金 免 疫 技 術金 免 疫 技 術吸水紙吸水紙金標抗體包被抗體抗金標抗體吸水紙吸水紙金標抗體包被抗體抗金標抗體化學發(fā)光免疫分析技術 化學發(fā)光酶免疫測定：測定過程與傳統(tǒng)ELISA相似，僅最后一步酶反應所 用底物為發(fā)光劑（魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系）化學發(fā)光免疫分析技術 化學發(fā)光酶免疫測定：測定過程標記免疫技術的分類一、按指示標記物質劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型標記免疫技術的分類一、按指示標記物質劃分的類型1、酶免疫技術2、熒光免疫技術3、放射免疫技術4、化學發(fā)光免疫分析技術5、金免

3、疫技術按指示標記物質劃分的類型1、酶免疫技術按指示標記物質劃分的類型1、均相型（homogenous）2、非均相型（異相型 heterogeneous）按測定方式劃分的類型1、均相型（homogenous）按測定方式劃分的類型均相型（homogenous）反應完成后，不用分離結合與游離的標記物非均相型（異相型heterogeneous）反應完成后，要分離結合與游離的標記物。又可分為液相異相免疫測定和固相異相免疫測定均相型（homogenous）非均相型（異相型heterog1、免疫測定技術2、免疫組化技術按測定用途劃分的類型1、免疫測定技術按測定用途劃分的類型第八章 酶免疫技術第八章 酶免疫技

4、術本章要求熟悉酶免疫技術的分類及原理；掌握ELISA的方法類型及各方法的原理；測定方法的標準化；熟悉酶免疫組織化學技術的原理；了解各類酶免疫組織化學技術；熟悉免疫印跡法的原理。本章要求熟悉酶免疫技術的分類及原理；酶免疫技術的基本原理酶免疫技術是以酶標記抗原或酶標記抗體為主要試劑，通過復合物中的酶催化底物呈色而對被測物進行定性或定量的標記免疫技術。 酶免疫技術的基本原理酶免疫技術是以酶標記抗原或酶在免疫組化染色時可指示待測反應物的存在和定位，在酶免疫測定中，則可根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技術是建立在抗原抗體反應和酶的高效催化作用的基礎上，故而該技術具有檢測靈敏度高、特異性

5、強、準確性好等特點，而且，可與其他技術偶聯(lián)而衍生出適用范圍更廣的新方法。 在免疫組化染色時可指示待測反應物的存在和定位，在酶 酶免疫技術的分類 按檢測對象的不同一般分為兩類 1.酶免疫組織化學技術 用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原或抗體。可指示待測反應物的存在和定位。2.酶免疫測定技術 用于檢測液體樣本中可溶性抗原或抗體。 根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。 酶免疫技術的分類 按檢測對象的不同一般分為兩標記免疫技術課件酶免疫技術的分類 根據(jù)抗原抗體反應后是否需要分離結合的和游離的酶標記物，可分為： 1. 均相法：不需要分離結合和游離的酶標記物，直接進行測定。 2. 異相法：需要分離

6、結合和游離的酶標記物后才能進行測定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫酶免疫技術的分類 根據(jù)抗原抗體反應后是否需要分離結酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)基本原理 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 標本中的抗原或抗體、標記抗原或抗體能按一定的次序與固相載體表面的抗體或抗原反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開。最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。 加入酶底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a

7、物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺對標本中的抗原或抗體定性或定量分析。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunos 方法類型及基本原理ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。雙抗體夾心法 雙位點一步法間接法 競爭法 捕獲法 雙抗原夾心法中和法方法類型及基本原理ELISA可用于測定抗原，也可用于測定一、雙抗體夾心法屬于非競爭結合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。 用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-

8、酶標抗體免疫復合物。由于反應系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(OD值)，即可確定待測抗原含量。一、雙抗體夾心法屬于非競爭結合測定。它是檢測抗原最常用（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。（2）加受檢標本：讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據(jù)顏色反應的程度進行該

9、抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結（二）雙位點一步法屬于雙抗體夾心法測定抗原；應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體；標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。但要注意防止鉤狀效應。（二）雙位點一步法屬于雙抗體夾心法測定抗原；（三） 雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進行包被和制備酶結合物

10、。形成“抗原-抗體-酶標記抗原”復合物（三） 雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進行包被和制備酶結合物四、間接法此法是測定抗體最常用的方法,屬非競爭結合試驗。 基本原理:將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結合成固相抗原-受檢抗體復合物，再用酶標二抗(針對受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體)與固相免疫復合物中的抗體結合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。四、間接法此法是測定抗體最常用的方法,屬非競爭結合試驗。 特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合抗原及雜質；加待測血清，血清中若有相應的抗體則與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合

11、物。洗滌后，固相載體上僅剩下特異性抗體。其他免疫球蛋白及雜質不能與固相抗原結合被去除；加酶標抗免疫球蛋白（酶標抗抗體）與固相復合物中的抗體相結合。洗滌后，固相載體上的酶量與待測血清中特異性抗體的量相關。若欲測人對某種病原微生物的抗體，可用酶標記羊抗人IgG抗體；加入底物顯色，顏色深淺代表樣本中待測抗體量。 特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合抗原五、競爭法 方法和特點: 酶標記抗原（抗體）與樣品或標準品中的非標記抗原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結合的能力； 測定管中加入待測樣本與一定量酶標抗原（抗體）的混合溶液，使兩者競爭性的與固相抗體（抗原）反應； 免疫反應后，結合于

12、固相載體上復合物中被測定的酶標抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標準品中非標記抗原（抗體）的濃度成反比。 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。五、競爭法 方法和特點: 標記免疫技術課件六、捕獲法測IgM抗體 先將針對IgM的第二抗體連接于固相載體，用以結合（“捕獲”）樣品中所有IgM（特異或非特異），洗滌除去IgG等無關物質，然后加入特異抗原與待檢IgM結合；再加入抗原特異的酶標抗體，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標抗體復合物，加酶底物作用顯色后，即可對樣品中待檢IgM是否存在及其含量進行測定。 六、捕獲法測IgM抗體 先將針對IgM的第二抗體連接于固相載抗-鏈（或抗-IgM抗體）包被在固相

13、上，形成固相抗-鏈（或抗-IgM抗體），洗滌；加入稀釋待測樣本，樣本中所有的IgM與抗-鏈結合，洗滌除去未結合物質；加入特異性抗原，它只與固相上特異性的IgM結合。洗滌；加入針對特異性抗原的酶標抗體，使之與結合在固相上抗原結合，洗滌；加底物顯色，若有顏色顯示，則表示待測樣本中有特異性的IgM抗體存在。抗-鏈（或抗-IgM抗體）包被在固相上，形成固相抗-鏈七、中和法常用于已知中和抗原檢測樣本中的未知抗體。在固相上包被已知抗體，當檢測樣本中含有待測抗體時，與反應體系中加入的中和抗原結合，反應過程不能形成“抗體-抗原-酶標記抗體”復合物，加入底物不顯色，實驗結果判為陽性；當檢測樣本中無待測抗體時，加

14、入的中和抗原則與固相抗體結合，形成“抗體-抗原-酶標記抗體”免疫復合物，加入底物顯色，實驗結果判為陰性。七、中和法固相酶免疫測定的技術要點ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液固相酶免疫測定的技術要點ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸試劑的準備固相載體：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白質的能力較強，抗體或蛋白質抗原吸附其上并保留原來的免疫活性。載體的性狀主要有三種：小

15、試管、小珠和微量ELISA板。抗原和抗體：所用抗原要求純度高，抗體效價高，結合力強。酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶試劑的準備固相載體：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白質的酶和酶作用底物要求活性高 有可結合的基團，不影響抗原抗體的免疫活性 反應產物易于判定或測量，方法簡單,敏感,重復性好 酶活性不受樣品中其他成分的影響,在均相酶免疫測定抗原抗體反應后酶活性可被抑制或激活 本身及產物無危害,性質穩(wěn)定,價廉易得 酶和酶作用底物要求活性高 常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 D + 2H2O 底物 受氫體 E 有色物質 辣根過氧化物酶 (HRP) 鄰苯二胺(OPD

16、) 靈敏度高,比色方便，穩(wěn)定性差,避光,致癌 四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 穩(wěn)定性好,無致突變作用，水溶性差堿性磷酸酯酶 (AP) 底物: 對硝基苯磷酸酯（p-NPP） 產物: 黃色的對硝基酚-半乳糖苷酶 (-Gal)底物: 4-甲基傘酮基-D-半乳糖苷(4MuG) 產物: 4-甲基傘形酮(熒光計測量)常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 酶 底物 顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 橙黃色 492 四甲基聯(lián)苯胺 黃色 450 氨基水楊酸 棕色 550 2,2-氨基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽藍綠色 642 堿性磷酸酯酶 對硝基苯磷酸酯（p-NPP）黃色 405 -半乳糖苷酶 4

17、-甲基傘酮基-D-半乳糖苷熒光 360,450 酶 底物 顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 橙黃常用酶 底物 加終止液前顏色 加終止液后顏色 辣根過氧化物酶（HRP） 鄰苯二胺（OPD） 橙黃色 棕黃色 RZ3.1 四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 藍色 黃色 堿性磷酸酶（AP） 對硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黃色 黃色 常用酶 底物 加終止液前顏色 加終止液后顏色 辣根過氧化物酶標記免疫技術課件交聯(lián)法 交聯(lián)法是以一可同時與酶和抗體（抗原）結合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結合物為： 酶-1-戊二醛-2-抗體（抗原） 1=2

18、同源雙功能交聯(lián)劑 戊二醛 1=2 異源雙功能交聯(lián)劑 羥琥珀亞胺酯 戊二醛易揮發(fā)，久置可發(fā)生聚合和氧化，降低交聯(lián)作用。由于戊二醛單體的光吸收峰是280nm，而聚合體則在235nm，故新鮮的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛應避光.低溫保存。 交聯(lián)法 直接法 直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團直接可與抗體（抗原）結合形成標記物，如過碘酸鈉法。形成的結合物為：酶-抗體（抗原）。 直接法 測定方法的標準化包被+封閉加樣洗滌孵育終止反應結果的判定測定方法的標準化包被+封閉包被將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被(coating)。蛋白質與聚苯乙烯固相載

19、體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。包被將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被(coating包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在Fc

20、段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。包被用抗原：包被條件pH9.6 碳酸鹽緩沖液pH7.2 的磷酸鹽緩沖液蛋白質用包被液稀釋后加入酶標板（100或200l/孔），在4-8冰箱中放置過夜或37中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。包被條件pH9.6 碳酸鹽緩沖液封閉封閉(bloc

21、king)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 200l/孔10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。 封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白（二）加樣 定量測定加樣量應力求準確，加樣時應將液體加在孔底，力求不產生氣泡。樣本和結合物的稀釋應按規(guī)定配制。 一般100l/孔（三）洗滌 洗滌是決定實驗成敗的關鍵。其目的是洗去沒有與固相抗原或抗體結合的物質，以及非特異性吸附于固相載體的干擾物質。 Tween 2

22、0在ELISA中最為常用，洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗滌步驟（二）加樣孵育 (incubation) 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為孵育 加樣品后、加結合物后都要孵育 孵育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。 一般孵育30-60min，溫度低，時間可延長。孵育 (incubation) 抗原抗體完成反應的保溫過程終止反應硫酸 檸檬酸 氫氧化鈉 不同的底物有不同的終止劑 終止反應硫酸 （五）結果的判定 分光光度計檢測結果可簡單地用吸光度值（A）表示，并

23、且根據(jù)每次試驗所用的陰性和陽性樣本確定標準。一般以A/A02.1（A：樣本吸光度值，A0：陰性對照吸光度值）表示，但陰性對照吸光度值必須大于0.05（最理想的是0.1），若低于0.05，則以陰性對照吸光度值加0.05為陽性判斷標準，這種結果判定方式目前最常用。用標準抗原或抗體做一系列稀釋度檢測，將測定的A值繪成標準曲線，可對樣品中抗原或抗體定量。用肉眼判斷結果時，所用的底物必須顯示較深的顏色。肉眼觀察只能判斷陽性和陰性（如+、+、+、+/、）。（五）結果的判定 分光光度計檢測結果可簡單地用吸光度值（A）標記免疫技術課件酶免疫組織化學技術（EIHCT ）是在一定條件下，應用酶標抗體(抗原)與組織

24、或細胞標本中的抗原(抗體)發(fā)生反應。如組織或細胞中含有相應抗原(抗體)，二者結合形成的抗原抗體復合物中所帶酶分子遇到底物時，催化底物產生顯色反應，在光鏡和電鏡下，就可識別出標本中抗原(抗體)的分布位置和性質；經(jīng)圖像分析也可達到定量的目的。EIHCT主要用于標本中抗原(抗體)的定位和定性檢測，常用的標本有組織切片、組織印片和細胞涂片等，最常用的酶是HRP，供氫體是DAB。與熒光免疫技術相比，EIHCT具有染色標本可長期保存?？捎闷胀ü忡R和電鏡觀察結果。EIHCT可分為酶標記抗體免疫組化技術、非標記抗體酶免疫組化技術和酶免疫電鏡技術三種類型。 酶免疫組織化學技術（EIHCT ）是在一定條件下，應用

25、酶標抗標記免疫技術課件標記抗體免疫組織化學技術1、直接法 用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應，形成抗原-酶標抗體復合物，加底物顯色，鏡檢。其技術要點：標本用0.3%H2O2和80%甲醇液處理15 min，消除內源性過氧化物酶，石蠟切片需常規(guī)脫蠟，用胰酶37消化，PBS洗滌；用10%牛血清白蛋白封閉15 min，即制得抗原片；加酶標記抗體，濕盒37溫育30 min或4過夜，PBS洗滌；加底物顯色，光鏡下觀察結果。該法具有操作簡便、快速、特異性強、非特異顯色低的優(yōu)點，但一種酶標抗體只能檢測一種特異性抗原，敏感性較低。2、間接法 用已知抗體（Abl）與標本中相應抗原（Ag）反應，形成Ag-Abl復

26、合物，加酶標記抗抗體（Ab2-E）反應，形成Ag-Abl-Ab2-E復合物，加底物顯色，鏡檢。其技術要點：按直接法制備抗原片，加Abl（如鼠抗X），濕盒37溫育30 min，PBS洗去未結合Abl；加酶標記抗抗體（如羊抗鼠Ig），濕盒37溫育30 min，PBS洗滌；加底物顯色，光鏡下觀察結果。間接法用一種酶標記抗抗體與多種特異性抗體結合，可檢測多種抗原，實用性與敏感性均較直接法好。標記抗體免疫組織化學技術1、直接法 非標記抗體酶免疫組織化學技術原理酶標記抗體的方法，由于酶與抗體共價連接，抗體和酶的活性均受到一定的損害，若非特異性抗體同時被標記，將出現(xiàn)非特異性著色。非標記抗體酶法，是先用酶免疫動物，制備高效價、特異性的抗酶抗體，將酶與抗酶抗體結合形成復合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，與抗酶抗體和組織抗原上的抗體（Ab1）結合，通過酶底物的顯色反應檢測抗原。非標記抗體酶免疫組織化學技術