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文檔簡介
1、乙肝病毒檢測乙肝病毒檢測病毒鑒定方法一、分離培養(yǎng)方法二、快速診斷方法1、光學(xué)顯微鏡檢查 病毒包涵體及某些大病毒顆粒的檢查2、電子顯微鏡的檢查 電鏡直接檢查 免疫電鏡檢查3、血清學(xué)檢查4、病毒基因組檢查 核酸雜交和聚合酶鏈反應(yīng)病毒鑒定方法一、分離培養(yǎng)方法乙肝病毒檢測一、乙肝五項(兩對半)二、乙肝病毒核酸定量檢測乙肝病毒檢測一、乙肝五項(兩對半) HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義IgMIgG+-感染或無癥狀攜帶者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎(傳染性強) (大三陽)+-+-+急性肝炎趨向恢復(fù)(小三陽)-+-+-+既往感染恢復(fù)期-+-+-既往感
2、染恢復(fù)期-+既往感染-+-既往感染或接種疫苗-未感染,無免疫力 HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測臨床意義HBsAg抗-HBsHBeA淺談乙肝病毒檢測課件淺談乙肝病毒檢測課件二、乙肝病毒核酸定量檢測1.檢測原理 利用熒光PCR技術(shù),以HBV基因組中相對保守區(qū)為靶區(qū)域,設(shè)計特異引物及熒光探針,通過PCR對DNA進行快速定量檢測。 熒光探針TaqMan 探針實時熒光 PCR 技術(shù)。在 PCR 反應(yīng)過程中,同時利用 Taq 酶的 53聚合酶活性和核酸外切酶活性,使得 TaqMan 探針降解,熒光報告基團和淬滅基團分離使得熒光信號發(fā)射, FAM 熒光檢測乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波長通道檢測內(nèi)參。二
3、、乙肝病毒核酸定量檢測1.檢測原理PCR分四個階段PCR分四個階段如何定量?Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中,熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。如何定量?Ct值的概念定量原理確定初始模板的濃度初始 DNA量越多, 熒光達到某一值(域值)時所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量定量原理確定初始模板的濃度初始 DNA量越多, 熒光達到某熒光化學(xué)SYBR Green 1 TaqMan熒光化學(xué)SYBR Green 1 TaqManTaqManTaqManSYBR Green I 工作原理。 SYBR G
4、reen 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未結(jié)合SYBR Green 1 dye變性: 無熒光信號SYBR Green I 工作原理。 SYBR Green2.所用試劑組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分 核酸提取試劑DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液質(zhì)控品及陽性定量參考品陰性質(zhì)控品250ul/管1HBV陰性血清強陽性質(zhì)控品250ul/管1滅活HBV陽性血清臨界陽性質(zhì)控品250u
5、l/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品(2.0X106IU/ml)250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品(2.0X105IU/ml)250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品(2.0X104IU/ml)250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品(2.0X103IU/ml)250ul/管1滅活HBV陽性血清 PCR檢測試劑HBV-內(nèi)標溶液100ul/管1內(nèi)標質(zhì)粒及穩(wěn)定劑HBV-PCR反應(yīng)管1人一份/管20引物、探針、taq酶等2.所用試劑組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分 核酸提取試劑D3、實驗步驟1.DNA提取 將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強陽性質(zhì)控品、
6、 HBV臨界質(zhì)控品進行同步處理。1.1 取200 L樣品,加入450 L DNA提取液I和4 L內(nèi)標溶液,用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒,瞬時離心數(shù)秒,100處理10分鐘1.2 12000rpm離心5分鐘,備用2.PCR試劑準備直接使用HBV-PCR反應(yīng)管3. 加樣HBV-PCR反應(yīng)管分別加入將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強陽性質(zhì)控品、 HBV臨界質(zhì)控品上清20 L。蓋緊管蓋,8000rpm離心數(shù)秒后擴增3、實驗步驟1.DNA提取4.PCR擴增對各標本進行標記反應(yīng)條件:93 2分鐘93 45秒55 60秒10個循環(huán)93 30秒45 60秒30個循環(huán)FAM通道檢測HBV核酸,VIC通
7、道檢測內(nèi)標4.PCR擴增4.結(jié)果判定1 如果在FAM檢測通道檢測擴增曲線無明顯對數(shù)期或Ct值等于30,VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)期,則為陰性或小于檢測靈敏度2 FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于30按以下方法判斷:C100,HBV DNA濃度5.0E+008 ,HBV DNA濃度5.0X108 IU/ml 如需精確定量結(jié)果,可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測,則樣品HBV DNA濃度=(CX稀釋倍數(shù)) IU/ml4.結(jié)果判定5.注意事項1 每次實驗需檢測陰性質(zhì)控品、HBV強陽性質(zhì)控品、 HBV臨界質(zhì)控品,滿足要求方可進行判定(陽性質(zhì)控品Ct30,陰性質(zhì)控品無明顯對數(shù)期
8、或Ct值等于30 VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)期)2 本試劑盒的最低檢出濃度為30IU/ml,最低定量濃度為100IU/ml3 所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標本對待嚴格遵循無菌操作(帶口罩手套),所有操作在生物安全柜內(nèi)操作,物品不能隨意帶出生物安全柜,用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。5.注意事項一、乙肝病毒e抗原檢測1.檢測原理 在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體( HbeAb),配以辣根過氧化物酶標鼠抗-Hbe單克隆抗體( HbeAb-HRP)及TMB(四甲基聯(lián)苯胺)等試劑,采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原( HbeAg)一、乙肝病毒e抗原檢測1.檢測原理淺談乙肝病毒檢
9、測課件2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板(包被鼠抗-Hbe單克隆抗體( HbeAb)96TX塊7.底物B(過氧化氫)7mlX1支2.HbeAg酶標抗體(辣根過氧化物酶標鼠抗-Hbe單克隆抗體)3.5mlX1支8.終止液7mlX1支3.HbeAg陽性對照血清(含HbeAg陽性血清)1mlX1支9.封口膜2張4.HbeAg陰性對照血清(正常人血清)1mlX1支10.自封袋1個5.濃縮洗滌(PBS-T緩沖液)12.5mlX1支11. 說明書1張6.底物A(過氧化氫)7mlX1支2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板963、實驗步驟1.平衡 試劑盒個組分取出,平
10、衡至室溫(16-25)余者以自封袋封存2.配液 濃縮洗滌液搖勻后,用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋備用3. 編號 微孔條固定于支架,按序編號4.加樣 分別用加樣器加入陽性對照血清、陰性對照血清50 L(各加兩孔),待測血清50 L(1孔),空白對照(不加)3、實驗步驟1.平衡5.加酶 每空加酶標抗體50 L,混勻(空白對照不加)6.溫浴 37溫浴25分鐘,室溫平衡5分鐘(封口膜覆蓋孔口,避免其他因素影響)7.洗滌 洗滌液充分洗滌5次,洗滌完扣干(每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間)8.顯色 每孔加入A、B底物50 L,混勻,37暗置15分鐘9.終止 每孔加50 L終止液50 L,混勻10.測定 酶標儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各空OD值,記錄結(jié)果,30分鐘內(nèi)測定完成)5.加酶4.結(jié)果判定1. 臨界值(C.O)計算 臨界值=陰性對照孔OD值均值N X 2.1 注意:陰性對照孔均值N大于0.1應(yīng)重新實驗,小于0.05按0.05計算2. 結(jié)果判定樣品OD值/ C.O 1為HbeAg陽性樣品OD值/ C.O 1為HbeAg陽性3.陰性對照孔均值N大于0.1或陽性對照均值0.4實驗無
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