研究生免疫組織化學(xué)染色技術(shù)課件

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)的定義免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry, IHC)是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)的抗原（或抗體）的分布進(jìn)行定位、定性、定量檢測，經(jīng)過組織化學(xué)呈色反應(yīng)在組織原位顯示抗原（或抗體），如各種蛋白質(zhì)、多肽、磷脂和多糖等成分的一門新技術(shù)。免疫組織化學(xué)技術(shù)的定義免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohist免疫組織化學(xué)的應(yīng)用 IHC通過檢測細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面或細(xì)胞間的正常或異常的物質(zhì)，以研究組織細(xì)胞的正常生理、代謝及疾病的病因、發(fā)病機(jī)理，廣泛用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測，細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究，以及細(xì)胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的

2、研究等。武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)的應(yīng)用 IHC通過檢測細(xì)胞實驗名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 簡稱S-P法)檢測胃癌組織CKVimentin的蛋白表達(dá)武漢大學(xué)病理教研室實驗名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結(jié)法武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異性一抗待測抗原武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異免疫組織化學(xué)基本實驗流程組織、細(xì)胞標(biāo)本 抗原修復(fù) 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶 正常血清封閉 滴加特異性一抗滴加二抗 滴加三抗顯色復(fù)染封

3、片 武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)基本實驗流程組織、細(xì)胞標(biāo)本 抗原修復(fù) 阻斷內(nèi)源具體步驟如下：1石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；2所有組織均采用微波修復(fù)抗原； 3室溫冷卻后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；4滴加50l過氧化物酶阻斷液（試劑A），37濕盒孵育 10min；50.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；6滴加非免疫性動物血清（試劑B），37濕盒孵育 10min；武漢大學(xué)病理教研室具體步驟如下：武漢大學(xué)病理教研室7甩去多余血清，分別滴加種抗體，4濕盒孵育 過夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35m

4、in；8滴加生物素標(biāo)記的二抗（試劑C），37濕盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；9滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D），37濕盒孵育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min ；10每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應(yīng)時間（約為1-5min），自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染；11常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片并鏡檢分析；12陽性對照采用已知陽性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對照采用PBS取代第一抗體，其余步驟相同。武漢大學(xué)病理教研室7甩去多余血清，分別滴加種抗體，4濕盒孵育 過夜，0實驗流程中的注意事項內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 血清

5、封閉 沖洗 抗體選擇及一抗孵育時間檢測及顯色系統(tǒng)復(fù)染 武漢大學(xué)病理教研室實驗流程中的注意事項內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 武漢大學(xué)病理教研染色前處理 取材、脫水、浸蠟組織及時固定 固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林 4%多聚甲醛常規(guī)下固定8-24小時取材厚度：2mm武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 取材、脫水、浸蠟組染色前處理 預(yù)防脫片常選用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）應(yīng)嚴(yán)格控制使用次數(shù) 2）玻片潔凈度武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 預(yù)防脫染色前處理 包埋與切片 包埋：選擇低熔點石蠟，溫度不超過62切片：厚度 3-4m 烤片：溫度60，時間1小時；或602小時（邁新）；或60過夜武

6、漢大學(xué)病理教研室染色前處理 包埋與切染色前處理 切片保存切片不宜長時間在常溫下保存武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 切片保存染色前處理 脫臘原則：免疫組化的脫蠟試劑應(yīng)與常規(guī)HE 脫蠟分開武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 脫臘原則實驗操作中的應(yīng)用抗原修復(fù) 實驗操作中的注意事項 武漢大學(xué)病理教研室實驗操作中的應(yīng)用抗原修復(fù) 武漢大學(xué)病理教研室抗原修復(fù) 影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素 抗原修復(fù)方法分類 1）酶消化法 2）加熱法（高壓法水煮法微波法）抗原修復(fù)液的選擇 1）檸檬酸鹽緩沖液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0） 武漢大學(xué)病理教研室抗原修復(fù) 影響染色結(jié)果的最關(guān)

7、鍵因素 武漢大學(xué)病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 存在部位：紅細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、粒細(xì)胞、 單核細(xì)胞、肝細(xì)胞及腎細(xì)胞消除方法：3% H2O2 浸泡10分鐘武漢大學(xué)病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 存在部位：紅細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、粒細(xì)胞血清封閉 目的：減少非特異性著色 時間：一般在加載一抗之前使用 武漢大學(xué)病理教研室血清封閉 目的：減少非特異性著色 武漢大學(xué)病理教研室沖 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分沖洗增加效果 可加入Tween20武漢大學(xué)病理教研室沖 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分沖洗武漢一抗孵育時間及抗體選擇應(yīng)選擇信譽(yù)高、質(zhì)量好的試劑公司抗體切忌反復(fù)凍融一抗為濃

8、縮液時，需選擇最佳稀釋濃度按說明書可采用 37 1-2 小時或 4 冰箱過夜武漢大學(xué)病理教研室一抗孵育時間及抗體選擇應(yīng)選擇信譽(yù)高、質(zhì)量好的試劑公司武漢大學(xué)檢測及顯色系統(tǒng)一般采用以生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測方法。如SP、LSABC、ABC等 顯色方法：經(jīng)常采用辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測 武漢大學(xué)病理教研室檢測及顯色系統(tǒng)一般采用以生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)的檢顯色系統(tǒng)常用的酶 1.辣根過氧化物酶(HRP) A:顯色底物DAB-棕黃色 敏感度高、定位清晰、易于觀察、保存 B:顯色底物AEC-磚紅色 2.堿性磷酸酶(AP) 顯色底物:BCIP/NBT-藍(lán)紫色武漢大學(xué)病理教研室顯色系統(tǒng)常用

9、的酶武漢大學(xué)病理教研室復(fù) 染原則：注意兩者之間對比，突出陽性信號武漢大學(xué)病理教研室復(fù) 染原則：注意兩者之間對比，突出陽性信號武漢大學(xué)病理教研實驗對照設(shè)計原則：所有檢測指標(biāo)均設(shè)陽性對照、陰性對照編號陽性片待檢片陰性對照結(jié)論1操作失誤，抗體失效2非特異性著色3陽性片不含靶抗原4待檢片不含定位抗原5待檢片含定位抗原武漢大學(xué)病理教研室實驗對照設(shè)計原則：所有檢測指標(biāo)均設(shè)陽性對照、陰性對照編號陽性結(jié)果分析1.特定的定位 胞膜型、胞漿型、全漿型或胞核型，局限性或彌散性。武漢大學(xué)病理教研室結(jié)果分析1.特定的定位 武漢大學(xué)病理教研室免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片CK10CD44v6ER武漢大學(xué)病理教研室免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片C

10、K10CD44v6ER武漢大學(xué)病理教研室2.染色的不均一性 陽性切片的染色應(yīng)分布不均，片狀或點狀散在分布；染色強(qiáng)弱也不等，顏色深淺反映抗原量的多少。 武漢大學(xué)病理教研室2.染色的不均一性武漢大學(xué)病理教研室人肝癌中EGFR的表達(dá)武漢大學(xué)病理教研室人肝癌中EGFR的表達(dá)武漢大學(xué)病理教研室3.顆粒性顯色 DAB顯色在高倍鏡下呈顆粒狀而非均勻著色。 武漢大學(xué)病理教研室3.顆粒性顯色武漢大學(xué)病理教研室29寫在最后成功的基礎(chǔ)在于好的學(xué)習(xí)習(xí)慣The foundation of success lies in good habits29寫在最后成功的基礎(chǔ)在于好的學(xué)習(xí)習(xí)慣謝謝聆聽 學(xué)習(xí)就是為了達(dá)到一定目的而努力去干, 是為一個目標(biāo)去戰(zhàn)勝各種困難