白細胞介素專業(yè)知識講座培訓課件

1、白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素：白細胞介素即是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子。目前至少發(fā)現(xiàn)了38個白細胞介素，分別命名為IL-1IL38，功能復(fù)雜，成網(wǎng)絡(luò)，復(fù)雜重疊;在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機體的多種生理及病例反應(yīng)。2白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素：2白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的由來：白細胞介素（interleukin,IL）最初是指由白細胞產(chǎn)生又在白細胞間發(fā)揮作用的細胞因子，雖然后來發(fā)現(xiàn)白細胞介素可由其他細胞產(chǎn)生,也可作用于其他細胞，這一名稱仍被沿用。在1979年第二屆國際淋巴因子專題討論

2、會上，白細胞介素將來自單核-巨噬細胞、T淋巴細胞所分泌的某些非特異性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和在炎癥反應(yīng)中起作用的因子稱為白細胞介素（interleukin，IL）。3白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的由來：3白細胞介素專業(yè)知識講座顯微鏡下的白細胞介素4白細胞介素專業(yè)知識講座顯微鏡下的白細胞介素4白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類IL-1：又稱淋巴細胞刺激因子。IL-2：又稱T細胞生長因子，TCGFIL-3：又稱為多能集落刺激因子（multi-csf）。IL-4：由抗原或絲裂原刺激的cd4+t細胞產(chǎn)年，活化的肥大細胞亦可產(chǎn)生il-4。IL-5：由抗原活化的cd4+t細胞產(chǎn)生；肥大細胞也能產(chǎn)生il-5。

3、IL-6：可由多種細胞合成，包括活化的t細胞和b細胞、單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞以及成纖維細胞等。5白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類IL-1：又稱淋巴細胞刺激因子。5白細胞介素白細胞介素的分類IL-7 ：il-7是由骨髓基質(zhì)細胞分泌的糖蛋白，分子量為25kd；其基因位于第8號染色體。IL-8 ： il-8主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生；其他如成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞等亦可在適宜的刺激條件下產(chǎn)生il-8。IL-9：細胞來源：il-9主要是由th細胞產(chǎn)生，在人和實驗鼠的體內(nèi)都可以自我合成。IL-101、細胞來源：il-10的分子量為3540kd，通常為二聚體；主要由th2細胞產(chǎn)生

4、，也可由單核細胞、角質(zhì)細胞及活化的b細胞產(chǎn)生。 6白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類6白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類IL-11：il-11由骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生，分子量約為23kd，是造血微環(huán)境中一個多功能的調(diào)節(jié)因子。IL-12：il-12主要由b細胞和巨噬細胞產(chǎn)生；其分子是一種異型二聚體，40kd（p40）和35kd(p35)的2個亞基通過二硫鍵相連接。IL-13:細胞來源：il-13由th2細胞產(chǎn)生，分子量約10kd；其基因位于第5號染色體上，與il-4基因緊密連接。il-13分子的氨基酸順序與il-4有2025的同源性，在功能上也與il-4有許多相似之處。7白細胞介素專業(yè)知識講座

5、白細胞介素的分類7白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類IL-14;il-14由t細胞分泌，其成熟形式含468個氨基酸殘基，可刺激活化的b細胞增殖，抑制絲裂原誘導(dǎo)的b細胞分泌免疫球蛋白。IL-15：il-15是新發(fā)現(xiàn)的一種因子，可由活化的單核巨噬細胞、表皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生。8白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素的分類IL-14;il-14由t細胞分泌，其成熟白細胞介素2(IL-2)細胞來源：主要由T細胞產(chǎn)生。又稱T細胞生長因子。作用方式：以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)。主要生物學功能：（1）活化T細胞，促進細胞因子產(chǎn)生（2）刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性及產(chǎn)生細胞因子，誘導(dǎo)LAK細

6、胞產(chǎn)生。（3）促進B細胞增殖和分泌抗體。9白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素2(IL-2)細胞來源：主要由T細胞產(chǎn)生。又稱T細白細胞介素2生產(chǎn)工藝流程 發(fā)酵工程菌為大腸桿菌。種子用LB培養(yǎng)基；發(fā)酵用M9CA培養(yǎng)基，3010小時，后提高溫度至42，誘導(dǎo)3小時。10白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素2生產(chǎn)工藝流程 發(fā)酵10白分離純化包涵體制備： 離心收集，菌體懸于EDTA溶液中，用超聲波破碎細胞，后8000r/Min離心，收集沉淀（包涵體和細胞碎片）11白細胞介素專業(yè)知識講座分離純化包涵體制備：11白細胞介素專業(yè)知識講座包涵體洗滌及裂解用Tris-HCL洗滌3次，離心收集沉淀，用鹽酸胍變性，離心收集上

7、清液。凝膠過濾及復(fù)性：上清過Sephacryl S-200柱，醋酸液洗脫，收集洗脫峰。干燥：冷凍真空干燥。12白細胞介素專業(yè)知識講座包涵體洗滌及裂解用Tris-HCL洗滌3次，離心收集沉淀，用目標基因克隆研究內(nèi)容研究方法PCR，文庫，化學合成表達載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化與篩選工程菌酶切，連接外源基因?qū)肱c培養(yǎng)新性狀、功能、物質(zhì)工程菌構(gòu)建流程13白細胞介素專業(yè)知識講座目標基因克隆研究內(nèi)容研究方法PCR，文庫，化學合成表達載體構(gòu)工程菌構(gòu)建的目標獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。14白細胞介素專業(yè)知識講座工程菌構(gòu)建的目標14白細胞介素專業(yè)知識講座白細胞介素專業(yè)知識講座培訓課

8、件大腸桿菌細胞：G，單細胞，桿狀。鞭毛、無芽孢、一般無莢膜。裂殖。 菌落:白色至黃白色，光滑，直徑23mm。16白細胞介素專業(yè)知識講座大腸桿菌細胞：G，單細胞，桿狀。鞭毛、無芽孢、一般無莢膜。大腸桿菌構(gòu)建技術(shù)1.PCR擴增PCR (Polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應(yīng)：在DNA聚合酶催化下，對特定的DNA序列進行的復(fù)制反應(yīng) 本質(zhì)：生物體DNA復(fù)制原理在體外合成DNA 發(fā)明者：Mullis，生物技術(shù)革命的象征，1993年獲得諾貝爾獎17白細胞介素專業(yè)知識講座大腸桿菌構(gòu)建技術(shù)1.PCR擴增17白細胞介素專業(yè)知識講座2.酶切反應(yīng) 概念：在特異位點上催化dsDNA分子的斷

9、裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。 酶切體系組成：目標和質(zhì)粒DNA，緩沖液，限制性內(nèi)切酶。 反應(yīng)條件：適宜溫度(37)，1小時以上。 終止反應(yīng)：加熱；加入EDTA，螯合鎂離子。 電泳檢查：酶切完全性。18白細胞介素專業(yè)知識講座2.酶切反應(yīng) 概念：在特異位點上催化dsDNA分子的斷裂，產(chǎn)3.連接反應(yīng)概念：DNA 雙鏈上相鄰的3-羥基和5-磷酸基因共價結(jié)合形成3-5-磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。 連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶。 連接反應(yīng)：16-26，數(shù)小時，或過夜。 終止反應(yīng)：在70加熱10分鐘。19白細胞介素專業(yè)知識講座3.連接反應(yīng)概念：19白細胞介素專業(yè)知識講座4.

10、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程；某一基因型細胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象20白細胞介素專業(yè)知識講座4.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程；20白細胞介素專大腸桿菌轉(zhuǎn)化法- CaCl2法 感受態(tài)細胞制備： 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10 分鐘，然后于4下離心10 分鐘。 棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30 分鐘后，4下，離心10 分鐘。 加入連接反應(yīng)產(chǎn)物：混勻，置冰上30分鐘。 熱擊：42，90s； 置冰上，12分鐘。 擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37，45分鐘。 涂平板

11、：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。 篩選培養(yǎng)：37，出現(xiàn)菌落。21白細胞介素專業(yè)知識講座大腸桿菌轉(zhuǎn)化法- CaCl2法 感受態(tài)細胞制備：21白細胞5.篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的細胞類型 非轉(zhuǎn)化子：沒有導(dǎo)入外源DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細胞 轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA的轉(zhuǎn)化細胞 非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子 重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子 目標重組子：含有連接正確的重組分子（目的） 非目標重組子：不含目的基因重組子22白細胞介素專業(yè)知識講座5.篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的細胞類型22白細胞介素專業(yè)知識講座篩選方法抗生素篩選法： 抗生素的抗性基因|氨芐青霉素23白細胞介素專業(yè)知識講座篩選方法抗生素篩選法：23白細胞介素

12、專業(yè)知識講座篩選方法籃白斑篩選法： lacZ基因，重組子白色，非重組子藍色。培養(yǎng)基中含X-galX-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 -半乳糖苷酶可以把培養(yǎng)基中無色的X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4-氯-靛藍，使菌落成藍色24白細胞介素專業(yè)知識講座篩選方法籃白斑篩選法： lacZ基因，重組子白色，非重組子藍鑒定方法 菌落PCR：含有目標基因 載體大小：電泳檢測 酶切鑒定：目標基因插入及插入方向 測序確證：目標基因的序列準確無誤25白細胞介素專業(yè)知識講座鑒定方法 菌落PCR：含有目標基因25白細胞介素專業(yè)知識講座工程菌構(gòu)建的質(zhì)量控制為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GMP及其有關(guān)生物制品研究技術(shù)指導(dǎo)原則，做好菌種的紀錄和管理。26白細胞介素專業(yè)知識講座工程菌構(gòu)建的質(zhì)量控制為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GM溫度對工程菌產(chǎn)物合成的影響生長與生產(chǎn)溫度不一致 較高溫度表達量達，易形成包涵體 策略：較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì) 對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞 策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解例如： 大腸桿菌和酵母生長最低溫度為10 大腸桿菌生長最適溫度為37，最高溫度為45 釀酒酵母：生長最適溫度為30，最高溫度為4027白細胞介素專業(yè)知識講座溫度對工程菌產(chǎn)物合成的影響生長與生產(chǎn)溫度不一致27白細胞介素白細胞介素2的應(yīng)用列舉