【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、3.1.1 重組DNA技術(shù)的基本工具導(dǎo)入擴(kuò)增基因工程發(fā)展歷程1944年艾弗里等人通過(guò)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個(gè)體間轉(zhuǎn)移。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個(gè)密碼子均被破譯成功。1970年科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。基因工程藥物成為世界各國(guó)研究和投資開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假

2、說(shuō)。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問(wèn)世。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。從社會(huì)中來(lái) 番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵害。當(dāng)番木瓜受到這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御

3、番木瓜環(huán)斑病毒。 DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？非轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)基因?qū)嶋H就是基因工程，那么什么是基因工程，需要那些工具？一、基因工程 就是按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品，從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。1、原 理：基因重組2、操作水平：DNA分子水平3、結(jié) 果：定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的生物

4、類型和生物產(chǎn)品1、不同生物的基因?yàn)槭裁茨芷唇樱?、外源基因?yàn)槭裁茨茉谑荏w細(xì)胞中表達(dá)？拓展1：(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。(2)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。(1)基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。(3)生物界共用一套遺傳密碼。相同的遺傳信息在 不同的生物體內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)?；蚬こ陶Q生的理論基礎(chǔ)二、 重組DNA技術(shù)的基本工具重組DNA技術(shù)的基本工具：（三）分子運(yùn)輸車-運(yùn)載體分子運(yùn)輸車（一）分子手術(shù)刀-限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀（二）分子縫合針-DNA連接酶 （一）分子手術(shù)刀-限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶） 1、來(lái)源： 主要

5、從原核生物中分離純化來(lái)的3、特點(diǎn) :4、作用部位:特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵5、結(jié)果：形成黏性末端和平末端 2、種類： 數(shù)千種能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。黏性末端黏性末端（1） EcoRI 限制酶的切割 被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。EcoRI 只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。平末端平末端（2） SmaI 限制酶的作用SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。 當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平

6、末端。 （3） 限制酶的識(shí)別序列 限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線；中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ，稱為回文序列。 在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。資料1限制酶名字的由來(lái) 用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的。 例如一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichia coli）的R型菌株分離來(lái)的，就用字母EcoR表示； 如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoR。小練習(xí)：粘質(zhì)沙雷氏

7、桿菌（Serratia marcesens）中分離的第一種限制酶即_Sma 1、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。2、如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端供體生物細(xì)胞取出DNA限制酶目的基因想一想：3、你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主

8、要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。1、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？ 通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。 練習(xí)與應(yīng)用 拓展應(yīng)用1練習(xí)與應(yīng)用 拓展應(yīng)用2有2個(gè)不同來(lái)源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶Hind、Xba、EcoR和Xho進(jìn)行切割，各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下：哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA 片段能與限制酶

9、Spe切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？Xba因?yàn)閄ba與Spe切割產(chǎn)生了相同的黏性末端（可互補(bǔ)）G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割(EcoR)把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？思考： 缺口怎么辦？G C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G兩種酶的作用對(duì)象是不是一樣的？，（二）分子縫合針-DNA連接酶1. 作用：2. 種類： Ecoli DNA連接酶 T4 DNA

10、連接酶將雙鏈 DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 。 可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，（1）Ecoli DNA連接或T4DNA連接酶連接粘性末端即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（2）T4 DNA連接酶可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，效率低（3）Ecoli DNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型來(lái)源EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別P72旁欄思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？ A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶

11、DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶(4)DNA聚合酶的作用DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵（5）DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：拓展2：比較以下幾種酶種類作用底物作用部位形成產(chǎn)物DNA連接酶DNA聚合酶限制酶解旋酶DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子DNA分子磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵重組DNA分子新的DNA分子含黏性末

12、端或平末端的DNA片段單鏈DNA項(xiàng)目?jī)?nèi)容載體類型作用條件質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等將外源基因送入受體細(xì)胞的工具假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，轉(zhuǎn)基因生物能產(chǎn)生預(yù)想的性狀嗎？霍亂弧菌的質(zhì)粒有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它做載體嗎？如果載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？如何確定目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞中了？對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源基因插入能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇（三）分子運(yùn)輸車-運(yùn)載體4、基因工程使用質(zhì)粒的特點(diǎn) 在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的，這些質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，如四環(huán)

13、素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選；大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來(lái)1.在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)選擇的限制酶為_(kāi)2.在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)選擇的限制酶為_(kāi)或*酶也會(huì)切割酶識(shí)別的序列，因此不能選擇酶思考討論 P73（1）剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。（3）不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。限制酶DNA連接酶載體對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害；有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；有特殊的標(biāo)記基因；能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、 噬菌體衍生物 、動(dòng)植物病毒小結(jié)基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來(lái)源：主要來(lái)源于原核生物特點(diǎn)：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵 種類： E.coliDNA連接酶、T4 DNA連接酶作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來(lái) 練習(xí)與應(yīng)用1、C 2、A拓展應(yīng)用(2)不同的限制酶切割可能產(chǎn)