番茄葉片中DNA、RNA的提取

1、重慶大學(xué)研究生專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告書實(shí)驗(yàn)課程名稱：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：學(xué)院：專業(yè)及類別：學(xué)號(hào)：姓名：實(shí)驗(yàn)日期：成績(jī)：重慶大學(xué)研究生院制實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握番茄葉片中DNA、RNA提取的原理與操作過(guò)程；2、了解DNA、RNA的組分，掌握DNA、RNA定性檢測(cè)的具體方法；3、掌握DNA、RNA的濃度與電泳測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、DNA的提取原理植物組織中絕大部分是核DNA，它和組蛋白、非組蛋白結(jié)合在一起，以核蛋白（即染色質(zhì)或染色體）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，hexadecyltrimethylammoniumbromide,簡(jiǎn)稱CTAB）：是一一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它

2、能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。在DNA提取過(guò)程中必須始終注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：（1）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、低鹽濃度、有機(jī)溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時(shí)避免使用變性的條件。（2）抑制內(nèi)外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加

3、以杜絕，現(xiàn)可以通過(guò)多種途徑來(lái)做到這一點(diǎn)：2、低溫操作；b、調(diào)節(jié)pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。（3）防止化學(xué)降解。如過(guò)酸或過(guò)堿以及其它化學(xué)因素，會(huì)使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。（4）防止物理因素降解。如溫度太高或機(jī)械張力剪切等，DNA分子特別大，其分子量可達(dá)1012道爾頓，極易被機(jī)械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動(dòng)也會(huì)使DNA斷裂，所以在抽提過(guò)程中要特別注意這一點(diǎn)，操作過(guò)程要盡量簡(jiǎn)便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要?jiǎng)×覔u動(dòng)。（5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對(duì)

4、核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。分離提取植物DNA的方法很多，本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法提取DNA并通過(guò)電泳鑒定。2、RNA的提取原理細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNAm大類，不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)不同方式去除蛋白，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過(guò)程。RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過(guò)程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可

5、溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失丫活人酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過(guò)酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。三、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1、實(shí)驗(yàn)試劑液氮、CTABbuffer、B-巰基乙醇、異戊醇、醋酸銨、1XTEbuffer、70%乙醇、RNAisoPlus裂解液、異丙醇、75%乙醇、氯仿、RNase-free水、瓊脂糖，冰2、實(shí)驗(yàn)儀器水平板型電泳槽裝置、電泳儀、移液槍、2ml離心管、1.5山1離心管、離心機(jī)、棉手套、塑料手套、電腦、燒杯四、實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的提取在液氮中將番茄葉片研磨成粉末；將研磨的樣品粉

6、末迅速轉(zhuǎn)到經(jīng)液氮預(yù)冷的2ml離心管中（約加到離心管400-500ulJ度處），加入1mlExtractionBuffer（CTABbuffe再勘口入20ulB-巰基乙醇，吹打或震蕩混勻；65孵育15min,5min后顛倒混勻；加入氯仿：異戊醇（體積比24:1）714立，室溫條件下8000rpm，離心5山也；取上清液700ul轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入70ul3M醋酸銨，顛倒混勻；加入726血的異戊醇，顛倒混勻；室溫條件下，7500rpm，離心5山也，去掉上清液，加入70%乙醇600ul清洗沉淀2次；13000rpm離心15山皿，棄掉乙醇，室溫干燥；向干燥的DNA加入50-100ul的1X

7、TEbuffer（或無(wú)菌水）溶解DNA。2、RNA的提取將1.5ml離心管提前用馬克筆做好標(biāo)記；在液氮中將番茄葉片研磨成粉末；將研磨好的樣品迅速裝入預(yù)冷的1.5ml離心管中，樣品的量到達(dá)離心管0.1刻度處，將離心管置于液氮中暫時(shí)保存，直到所有樣品都研磨完畢；用鑷子取出置于液氮中的盛有樣品的1.5ml離心管，向管中加入1ml的RNAisoPlus裂解液，迅速震蕩勻漿，直至勻漿液呈無(wú)顆粒透明狀，室溫靜置5min,然后12000rpm,4離心5min；小心吸取上清液（950ul）,移入新的離心管中，向勻漿裂解液中加入氯仿200ul,蓋緊離心管蓋，用手劇烈震蕩15秒，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5mi

8、n,然后12000rpm,4離心15min；從離心機(jī)中小心取出離心管，吸取上清液（250-320ul）轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，再向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30下靜置10min,然后12000rpm,4離心10min；從離心機(jī)中小心取出離心管，棄上清液后，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1ml,輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12000rpm,4離心5min后小心棄去乙醇；室溫干燥沉淀2-5min,加入適量（30-50ul）的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，RNA完全溶解后放置于冰上；制作瓊脂糖凝膠，取2-3ul進(jìn)行凝膠電泳，以查看R

9、NA提取的完整性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1DNA凝膠電泳條帶圖2RNA凝膠電泳條帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1與圖2所示，圖1中從右至左的第3條為本組的DNA凝膠電泳條帶，圖2中的從右至左的第4條（樣品1）與第6條（樣品2）為本組的RNA凝膠電泳條帶。2、結(jié)果分析DNA提取的分析由本組的DNA凝膠電泳條帶可知，我們組已成功提取出了番茄植物的DNA，條帶的亮度很暗，這說(shuō)明DNA濃度較低。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是樣品中的部分DNA被降解或斷裂。在DNA的提取過(guò)程中，可能造成其降解的因素主要有以下幾方面：加入提取液后，提取時(shí)間太久，這有可能造成部分降解。降入氯仿/異戊醇后，劇烈混勻時(shí)間太久，造成部分DN

10、A斷裂。打碎組織時(shí)最好用液氮處理后研磨的方式，用珠子打碎在后期混勻過(guò)程中也容易造成DNA斷裂。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一定要避免出現(xiàn)此類現(xiàn)象。RNA提取的分析本組在進(jìn)行RNA提取實(shí)驗(yàn)時(shí)，制備了兩個(gè)樣品。樣品1的RNA凝膠電泳條帶大致能看出由三個(gè)條帶，但顏色很淺，這表示RNA濃度較低，樣品1成功提取出了番茄植株的RNA；而樣品2的RNA凝膠電泳條帶的末端出現(xiàn)了一段很明亮的條段，這說(shuō)明樣品2中的RNAE被降解，沒能成功提取出番茄植株的RNA。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是樣品1中的RNA幾乎被RNA酶完全講解，而樣品2只是少量被降解了。在RNA的提取過(guò)程中，其很容易被降解，為了防止RNA的降解，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程

11、中應(yīng)特別注意以下幾個(gè)方面：所有用到的槍頭、離心管都要在0.1%的DEPC水里浸泡過(guò)夜夠，滅菌烘干使用，當(dāng)然這些耗材都有現(xiàn)成商業(yè)化的買。所有實(shí)驗(yàn)中用到水的地方都是0.1%的DEPC水（滅菌失活）。液氮研磨，裂解時(shí)間不宜太長(zhǎng)、擬南芥、水稻等模式作物抽提一次就可以用，有些作物需要純化，粗提出的RNA盡快純化，不要放太長(zhǎng)時(shí)間。DNA酶處理的時(shí)間要短，不超過(guò)30分鐘。盡量在低溫的條件下操作，戴口罩，在冰上操作時(shí)注意不要有水碰到管口、自來(lái)水，說(shuō)話時(shí)的口氣、唾沫都會(huì)污染RNA。六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)我本科所學(xué)專業(yè)是材料科學(xué)與工程，本次DNA、RNA的提取實(shí)驗(yàn)是我繼高中后首次接觸這方面的知識(shí)。實(shí)驗(yàn)課開始，老師先給我們先給我們?cè)敿?xì)講解了DNA、RNA提取的原理、方法與注意事項(xiàng)等方面，然后才是實(shí)驗(yàn)操作部分。本次實(shí)驗(yàn)是兩個(gè)人一組，我覺得兩個(gè)人一組剛剛好，這不僅讓每個(gè)同學(xué)都有親自操作的機(jī)會(huì)，遇見問(wèn)題時(shí)兩個(gè)同學(xué)還可以互相探討。本次實(shí)驗(yàn)我是跟同一課題組的馬娜同學(xué)一組的，她本科就是生物學(xué)專業(yè)的同學(xué)，在DNA、RNA的提取上有豐富的理論知識(shí)與實(shí)踐經(jīng)歷，她知道我本科不是生物學(xué)的，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程給予了我很多幫助與鼓勵(lì)，最開始的時(shí)候，我不敢自己操作，因?yàn)槲依鲜怯X得自