RhD陽性血影細(xì)胞的制備及應(yīng)用

1、文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .RhD陽性血影細(xì)胞的制備及應(yīng)用作者：石明雋，肖瑛，桂華珍，張國忠【摘要】目的： 探討用不同滲透濃度磷酸鹽液（PB）制備的 RhD陽性血影細(xì)胞的抗原性及其在抗 -D 抗體分離中的作用。方法：用不同滲透濃度 PB作為裂解液，將遺傳表現(xiàn)型為 CCDee的 RhD陽性 O型紅細(xì)胞制備成血影細(xì)胞，觀察其抗原性；以血影細(xì)胞為固相抗原，用親和層析法從抗D 含量為 0.814 mg/L 的健康人血漿中分離抗 -D 抗體，檢測相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：pH7.4 、30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞形態(tài)完整，保持較強的抗原性；成功獲得抗-D 抗體，

2、回收率達(dá)到84.65 ， IgG 單體加二聚體含量為99.3 %，不含抗 A、抗 B 血型抗體以及 IgA 、IgM 和血紅蛋白。結(jié)論：用 pH7.4、30 mmol/L PB 制備的血影細(xì)胞可作為固相抗原，并能從低效價血漿中分離純化抗-D 抗體。【關(guān)鍵詞】 RhD 抗原 抗-D 抗體 血影細(xì)胞血漿Abstract Objective:To investigatethe antigenicityof RhD ghost cells prepared with different concentrations ofphosphate solution (PB) and its applicati

3、on in the separationof anti D antibodyfromplasmawithlowantibodytiter.Methods：Red blood cells of O group withpositiveRhD(genotypeCCDee) wereemployed toprepareghostcellsusingPB withconcentrationsof40,30and20mmol/Lrespectively.Antigenicityof thesecellswas examined. AntiD antibody was1文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.wor

4、d 版本可編輯 .歡迎下載支持 .separated from the plasma containing 0.814 mg/L of antiD byusing affinitychromatography (AC) with the ghostcells as solidantigen. Results ： 1.The ghost cellspreparedwith PB (pH 7.4,30 mmol/L) kept complete cell morphology and strongantigenicity;2. The antiD antibody was separated su

5、ccessfully using ACmethod from plasma. The recovery rateof antiD was 84.65%, andcontents of monomer and dimmer reached 99.3% of total IgG. NoIgA, IgM or hemoglobin was found in thepreparation.Conclusion ：The ghost cells prepared by PB (pH 7.4, 30 mmol/L) can be usedas solid antigen to separate and p

6、urify antiD antibody fromplasma with low antiD titter.Key wordsRhD antigen ，antiD antibody;ghost cells;plasma抗-D 抗體被廣泛用于防止 RhD同種免疫 1,2 ，同時也用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜 3,4 。目前臨床使用的抗 -D 抗體均為人為免疫而得的血源制劑 5 ，而因妊娠等自然免疫而產(chǎn)生的獲得性抗D抗體，由于其血液中含量少，沒有受到重視而得到利用。2006 年用不同滲透濃度的磷酸鹽液（PB）制備 RhD陽性血影細(xì)胞，并探討其對血影細(xì)胞抗原性的影響， 探索用血影細(xì)胞從含低效價抗-

7、D 抗體的血漿中分離純化抗體的方法及其可用性。材料和方法1.1 材料2文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .健康人血漿（抗D為 0.814 mg/L，IgG 含量 9.63 g/L ，貴州省血液中心），Rh表型 CCDee的 O型紅細(xì)胞（貴州省血液中心） ，效價為 1256 的抗 D（IgG）血型抗體標(biāo)準(zhǔn)品（上海市血液中心） ，溶血素（中國生物制品質(zhì)量檢測所） ，F(xiàn)ITC- 兔抗人免疫球蛋白（晶美公司） ，MININEPHTMIgG抗血清（英國 The Binding site公司），99/728 抗-D抗體標(biāo)準(zhǔn)品 ( 英國 The NationalInstit

8、utefor BiologicalStandardsand Control ， NIBSC) ，免疫單擴(kuò)散板（上海捷門生物技術(shù)合作公司） 。8200 型超濾器、截留分子量30 kD 的超濾膜（美國Millipore公司），3K30型低溫高速離心機(jī)（德國 Sigma 公司），F(xiàn)ACSCabiber式細(xì)胞儀（美國 Becton Dickinson 公司），高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），MININEPSAN散射比濁儀（英國The Bingding Site公司）。1.2 血影細(xì)胞的制備O型 Rh表型 CCDee的紅細(xì)胞，等體積生理鹽水洗滌 3 次（1 000 r/min 5 min，4

9、 ），pH7.4，滲透濃度分別為 40、30 和 20 mmol/L的 PB多次洗滌離心（ 20 000 r/min 15 min ，4 ）至上清液無色，沉淀即為含 D抗原的血影細(xì)胞。1.3 血影細(xì)胞形態(tài)和抗原性檢測在光鏡下觀察血影細(xì)胞的形態(tài)。將血影細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗 -D 抗體37 孵育 30 min，離心取上清液，用RhD篩選細(xì)胞測定其抗體效價，標(biāo)準(zhǔn)抗 -D 抗體效價減去上清液效價反映血影細(xì)胞的抗原性，相同條件重復(fù)5次。1.4 血漿抗 D-抗體的分離純化3文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .血影細(xì)胞用 2%戊二醛 21 的體積比固定 30 min 后與血漿按12

10、 的體積比例混合， 37 輕柔攪拌 2 h，離心（1 000 r/min 5 min，4 ）棄上清，沉淀的細(xì)胞用 10 倍體積的 pH2.8，0.2 mol/L 的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫，離心（ 1 000 r/min 3 min ），洗脫液用 0.05 mol/L NaOH 調(diào) pH至 6.0 6.5 ，重復(fù)兩次，合并洗脫液，超濾濃縮至原血漿體積的 1/5 ，過濾除菌，冷凍干燥， 4 保存。 相同條件重復(fù) 7次。1.5 抗體測定終點散射比濁法測定IgG 含量，免疫單擴(kuò)散法檢測IgA 和 IgM含量，高效液相色譜法測定IgG 單體加二聚體含量，流式細(xì)胞術(shù)測定抗-D 抗體含量，鄰甲聯(lián)苯胺法行血紅蛋

11、白定性測定，試管法測定抗 A、抗 B 血型抗體。2 結(jié)果2.1 血影細(xì)胞的形態(tài)用滲透濃度為 20 mmol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，混有較多細(xì)胞碎片；用30 和 40 mmol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞呈透明圓形，未見明顯細(xì)胞碎片， 但 40 mmol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞內(nèi)含有少量血紅蛋白，細(xì)胞中心可見紅色。2.2 血影細(xì)胞的抗原性抗-D 標(biāo)準(zhǔn)品效價為 1256，表 1 顯示血影細(xì)胞與抗 -D 抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后，重復(fù) 5 次的結(jié)果。用 20 mmol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞與抗 -D 抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后， 四次上清液中的抗體效價為 1128；而用 30 和 40 mm

12、ol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞與抗 -D 抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后，4文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .上清液中的抗體效價在116 與 132 之間。表 1 標(biāo)準(zhǔn)抗體與血影細(xì)胞孵育后上清液的抗體效價（略）2.3 IgG含量、抗 -D 抗體含量和回收率用 30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞對血漿進(jìn)行親和層析得到的制劑中， IgG 含量為（ 4.24 1.53 ）g/L （n=7），其中單體加二聚體占99.9 0.25 ）（n=7）；抗-D 抗體的含量為（3.45 0.31 ）mg/L（n=7），回收率為（84.65 7.85 ）（n=7）；7 次重復(fù)得到的制劑均

13、不含抗A、抗 B 血型抗體以及 IgA 、IgM 和血紅蛋白。 2.4 分離純化過程對血影細(xì)胞的影響用 30 mmol/L PB 制備的血影細(xì)胞在 2%戊二醛固定后和親和層析后細(xì)胞形態(tài)略變小，而經(jīng)過洗脫液洗脫的血影細(xì)胞比固定后的細(xì)胞形體稍大，但細(xì)胞仍然呈完整圓形，細(xì)胞涂片光鏡下未觀察到細(xì)胞膜的碎片。見圖 1。討論本課題組曾用柱層析法從低效價血漿中分離得到含抗-D 抗體的 IgG6 ，再用經(jīng) 2 戊二醛固定的 RhD陽性紅細(xì)胞從 IgG 中純化抗-D 抗體。為提高抗 -D 抗體的回收率，設(shè)想直接用 RhD陽性紅細(xì)胞從含抗-D 抗體的血漿中分離純化該抗體。實驗發(fā)現(xiàn)，戊二醛固定 30 min 的紅細(xì)

14、胞與血漿接觸后出現(xiàn)血紅蛋白溢出現(xiàn)象，延長紅細(xì)胞固定時間和滅活血漿補體仍不能改善。鑒于 RhD抗原僅位于紅細(xì)胞膜上，參考 Litten 等7 ，8 方法，利用低滲的裂解液將血紅蛋白從紅細(xì)胞中釋放5文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .出來。結(jié)果表明，滲透濃度分別為 40、30 和 20 mmol/L 的 PB均可使紅細(xì)胞裂解而釋出 Hb，成為具有 D抗原性的血影細(xì)胞。 光鏡下，用 40 和 30 mmol/L 的 PB制備的血影細(xì)胞呈光滑圓形， 未見細(xì)胞膜碎片； 40 mmol/L PB 制備的血影細(xì)胞在細(xì)胞中心仍有少許 Hb，30 mmol/L PB 制備的血影

15、細(xì)胞內(nèi)不含 Hb。用 20 mmol/L PB 制備的部分血影細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見散在的膜碎片?？乖詸z測顯示，用40 和 30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞的抗原性明顯強于用20 mmol/L PB 制備的血影細(xì)胞。鑒于 30 mmol/L PB 制備的血影細(xì)胞保持了較強的抗原性并且不帶有Hb，應(yīng)用此血影細(xì)胞與含低效價抗-D 抗體的血漿進(jìn)行親和層析， 成功分離了抗 -D 抗體，抗 -D 抗體回收率提高到84.65%。同時制劑總 IgG量明顯低于血漿中的含量，不含A、B 血型抗體以及 IgM、IgA 和 Hb。結(jié)果還表明，經(jīng)過親和層析，血影細(xì)胞的形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，提示有再利用的可能性。

16、因此，用 30 mmol/L PB將遺傳表型為 CCDee的 O型紅細(xì)胞制備為具有完整 D抗原性的血影細(xì)胞，以此作為固相抗原與血漿進(jìn)行親和層析，可以從低效價血漿中分離純化抗-D 抗體，操作步驟簡單，抗-D 抗體的回收率較高?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1JabaraS,BarnhartKT. Is Rh immune globulinneed inearly firsttrimester abortion A reviewJ. Am J ObstetGynecol, 2003(3):623-627.2Augustson BM, Fong EA, Grey DE, et al. Postpartum6文檔來源為

17、 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯 .歡迎下載支持 .antiD:canwe safelyreducethedoseJ.MedJAust,2006(12):611-613.3Fung KF, Eason E, Crane J, et al. Prevention of Rh alloimmunizationJ. J Obstet Gynaecol Can, 2003(9):765-773.4Ambriz Fernandez R, Martinez Murillo C, Quintana Gonzalez S, et al.Fc recepteor blockade in patients

18、 withrefractory chronic immune thrombocytopenic purpura with anti D IgGJ. Arch Med Res, 2002(6):536 -540.5Kumar M, Vil TA, Johnson CS, et al. Treatment, outcome and cost of care in children with idiopathic thrombocytopenic purpuraJ. Am J Hematol, 2005(3):181-187.謝競，石明雋，張國忠 , 等. 抗 D抗體的提取工藝研究 J.中國生化藥物雜志， 2005(4):208-210.7Litten J, Culpepper R, Bakerman S. Studies on thecharacteri