廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種抗水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范》征

1、Q/LB.XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并宣貫。本文件由廣西農(nóng)業(yè)種植業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本文件主要起草人：秦碧霞、謝慧婷、崔麗賢、李戰(zhàn)彪、蔡健和、陳錦清。水稻品種抗水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了水稻品種抗水稻齒葉矮縮?。ú≡核君X葉矮縮病毒，Rice ragged stunt virus，RRSV）人工接種鑒定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)規(guī)范。本文件適用于水稻品種抗齒葉矮縮病鑒定評(píng)價(jià)和水稻種質(zhì)抗齒葉矮

2、縮病資源的篩選。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。水稻齒葉矮縮病 Rice ragged stunt disease由水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）侵染引起的水稻病毒病。病株 diseased plants 感染水稻齒葉矮縮病毒并表現(xiàn)相應(yīng)癥狀的水稻植株（病害鑒定調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)4.4.2）。發(fā)病率 the rate of diseased plants病株占調(diào)查水稻總植株數(shù)的百分率。無(wú)毒褐飛虱 non-viruliferous brown planthopper不攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱 (Nilaparv

3、ata lugens(Stl)。人工接種鑒定接種用褐飛虱的準(zhǔn)備褐飛虱的采集和飼養(yǎng)褐飛虱若蟲(chóng)或成蟲(chóng)采集自田間。在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用感蟲(chóng)水稻品種TN1（臺(tái)中本地1號(hào)）連續(xù)飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲(chóng)室條件為：溫度（281） , 相對(duì)濕度8090，光照周期L:D=12 h:12 h。無(wú)毒褐飛虱群體的獲得選取褐飛虱喜食的水稻品種（如TN1）的種子用清水常溫浸種24 h后，清洗干凈用濕布覆蓋，置恒溫箱（322） 催芽24 h48 h，選取出芽整齊一致的種子25粒30粒均勻撒播于盛有自然肥力土壤的無(wú)孔塑料花盆（上口徑20 cm，高14 cm，下同）中，放在60目防蟲(chóng)籠（下同）內(nèi)育苗，常規(guī)管理；（405）d后水稻進(jìn)入分蘗期，將懷卵的

4、褐飛虱單頭移入防蟲(chóng)籠中水稻苗上產(chǎn)卵，3 d后取出成蟲(chóng)，立即進(jìn)行帶毒率檢測(cè)或置于小型容器中-20 保存待檢。稻苗繼續(xù)培養(yǎng)7 d10 d，孵化出褐飛虱后代若蟲(chóng)群體，每群體取10頭20頭2齡或3齡若蟲(chóng)進(jìn)行帶毒性檢測(cè)。褐飛虱帶毒性檢測(cè)參見(jiàn)附錄A進(jìn)行，產(chǎn)卵成蟲(chóng)及其后代若蟲(chóng)均不帶毒的群體定義為無(wú)毒褐飛虱群體。毒源準(zhǔn)備病株采集采集田間表現(xiàn)水稻齒葉矮縮病疑似癥狀的水稻植株，移栽在無(wú)孔塑料花盆中，并置于防蟲(chóng)籠內(nèi)。病株檢測(cè)確定采疑似病株葉片，參見(jiàn)附錄A進(jìn)行水稻齒葉矮縮病毒檢測(cè)，確認(rèn)帶毒則將對(duì)應(yīng)的病株作為毒源保存在防蟲(chóng)籠中。病株純化擴(kuò)繁在防蟲(chóng)籠中，不帶毒褐飛虱在4.2.2病株上飼毒2d后接種健康水稻秧苗（TN1），

5、純化并擴(kuò)繁病株。接種鑒定參鑒水稻苗的準(zhǔn)備 參鑒品種（含感病對(duì)照TN1）經(jīng)4.1.2方法浸種、催芽；選取30粒發(fā)芽整齊一致的種子，分別點(diǎn)播于盛有自然肥力土壤的塑料杯(內(nèi)徑8 cm11 cm,下同)中，每品種重復(fù)3次。褐飛虱飼毒將經(jīng)檢測(cè)確定感染RRSV的4.2.3病株移栽于大燒杯(內(nèi)徑10 cm20 cm)中, 土面覆蓋濾紙, 將適量1齡2齡無(wú)毒褐飛虱移入燒杯中的水稻苗上飼毒, 并用60目防蟲(chóng)網(wǎng)覆蓋杯口。2 d后將已飼毒褐飛虱移入防蟲(chóng)籠內(nèi)無(wú)孔塑料花盆的水稻苗（TN1）上飼養(yǎng)，度過(guò)循回期（8d11d）后，每批隨機(jī)取出50頭褐飛虱高齡若蟲(chóng)或成蟲(chóng)，參見(jiàn)附錄A檢測(cè)單頭褐飛虱帶毒情況，計(jì)算褐飛虱群體帶毒率。

6、接種方法根據(jù)4.3.2測(cè)定的褐飛虱帶毒率，計(jì)算接蟲(chóng)數(shù)量后接入已育有參鑒品種的塑料杯中，接種苗齡為1.5葉2.5葉齡期，接種時(shí)間為2 d，接種溫度（281） ，每天上午和下午各趕蟲(chóng)一次，使褐飛虱分布均勻，2 d后用殺蟲(chóng)劑噴殺褐飛虱，把秧苗移栽到防蟲(chóng)網(wǎng)室水田池中，20 35 下常規(guī)管理，定期觀察植株發(fā)病情況。人工接種鑒定的有效接種蟲(chóng)量用IVS表示，數(shù)值以頭/苗計(jì)，按公式(1)計(jì)算：IVS=N*PVS(式中：IVS人工接種鑒定的有效接種蟲(chóng)量；N接種褐飛虱數(shù)量；PVS褐飛虱帶毒率。當(dāng)IVS值處于1頭2頭/株范圍內(nèi)，則試驗(yàn)有效。調(diào)查調(diào)查時(shí)間接種（255）d后，待感病對(duì)照癥狀明顯時(shí)開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況，同時(shí)確

7、定有效鑒定株數(shù)，間隔7 d調(diào)查一次，共調(diào)查3次。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)苗期發(fā)病癥狀：植株濃綠矮縮，分蘗增多，新葉葉尖扭曲呈螺旋狀，部分葉片葉緣出現(xiàn)鋸齒狀缺刻，或葉鞘和葉片基部出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的線狀脈腫；植株矮縮，葉色稍濃綠。病株判定出現(xiàn)4.4.2.1中a)癥狀的植物直接記為病株；出現(xiàn)4.4.2.1中b)癥狀的植株，參見(jiàn)附錄A檢測(cè)確認(rèn)。發(fā)病率計(jì)算根據(jù)感病對(duì)照3次調(diào)查的最高發(fā)病率確定待鑒品種發(fā)病率的計(jì)算方式，感病對(duì)照3個(gè)重復(fù)三次調(diào)查中的最高發(fā)病率均超過(guò)30，則認(rèn)定本次鑒定有效；若參鑒品種3個(gè)重復(fù)三次調(diào)查中的最高抗性級(jí)別差異均不超過(guò)1個(gè)等級(jí)，則認(rèn)定本次鑒定準(zhǔn)確。在鑒定有效且準(zhǔn)確的前提下，取3個(gè)重復(fù)三次調(diào)查中的最高發(fā)病

8、率確定品種的抗性級(jí)別。如果感病對(duì)照的最高發(fā)病率小于30，則認(rèn)定本次鑒定結(jié)果無(wú)效。發(fā)病率用Ri表示，數(shù)值以計(jì)，按公式(2)計(jì)算：Ri=nint式中：Ri發(fā)病率；ni病株數(shù)；nt總株數(shù)。計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位?？共⌒栽u(píng)價(jià)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：發(fā)病率為0，免疫；1級(jí)：發(fā)病率為0.015.00，抗?。?級(jí)：發(fā)病率為5.0115.00，中抗；5級(jí)：發(fā)病率為15.0130.00，中感；7級(jí)：發(fā)病率為30.0150.00，感?。?級(jí)：發(fā)病率大于50.00，高感?？剐栽u(píng)價(jià)當(dāng)品種抗性在不同地區(qū)間、不同年度間或批次間鑒定結(jié)果表現(xiàn)不一致時(shí)，抗性結(jié)果為其中的最差等級(jí)。（資料性）水稻齒葉矮縮病毒RT-

9、PCR檢測(cè)方法試劑除特別說(shuō)明以外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試劑均用無(wú)RNA酶污染的容器配置。液氮：保存于液氮罐或保溫桶中。RNAiso PLUS (購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司)。氯仿。異丙醇：-20 預(yù)冷。DEPC水：用0.1%DEPC（焦碳酸乙二酯）處理后的去離子水。75乙醇（DEPC水配制）。瓊脂糖。Tris 堿。冰乙酸。EDTA（0.5 mol/L）。50TAE配方：Tris堿242 g，冰乙酸57.1 mL，EDTA（0.5 mol/L）100 mL，定容至1 000 mL。PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit一步反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自寶生物工程（大

10、連）有限公司)。DNA Marker (購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司)。Gel-red染色工作液(購(gòu)自Invitrogen公司) 。儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括：稱量天平：精度等級(jí)為0.01 g；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（離心速度12 000 r/min以上）；冰箱（2 8 和-20 ）；微量可調(diào)移液器（10 L、100 L、1 000 L）及配套吸頭；離心管（1.5 mL、2.0 mL，RNAase-free）；研砵。檢測(cè)引物正向引物 RRSV-F 5-GCC TTT CGT GCA ATT CCC-3。 反向引物 RRSV-R 5-GCG TCA TCA CCA AAG TTA GCC-3。操作步驟采

11、樣工具下列采樣工具應(yīng)經(jīng)（1212） ，高壓滅菌15 min并烘干。剪刀，鑷子，研缽，Eppendorf管（1.5 mL、2.0 mL）。樣品采集單頭褐飛虱放入1.5 mL離心管中，新鮮水稻葉片或莖稈組織，放入密閉的自封袋內(nèi)，貼好標(biāo)簽，并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)或-20 保存待檢，存放不能超過(guò)7 d。樣品保存新鮮樣品若需長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70 以下，避免反復(fù)凍融?？俁NA提取步驟如下：?jiǎn)晤^褐飛虱直接在1.5 mL離心管中加入少量液氮用燒鈍的槍頭研磨，水稻組織取0.1 g放入研缽中，倒入適量液氮，以研磨棒將樣本磨碎至粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中；加入1 mL RNAiso plus，充分混勻

12、； 加入0.2 mL氯仿，蓋好管蓋，充分混勻至溶液呈乳白色，室溫靜置5 min；12 000 r/ min，4 離心15 min；吸取c)各管中的上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，不應(yīng)吸到中間層，向管中加入等體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min，4 離心10 min，棄上清，加入600 L75乙醇，上下顛倒洗滌；12 000 r/min，4 離心5 min，棄上清；4 000 r/min 離心10 s，小心棄上清，室溫干燥3 min5 min；加入10 L15 L DEPC水，輕輕混勻，冰上保存?zhèn)溆谩Ｈ粜栝L(zhǎng)期保存應(yīng)放置-70 冰箱。RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)

13、備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行。從試劑盒中取出相應(yīng)的RT-PCR反應(yīng)液，設(shè)所需RT-PCR檢測(cè)總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照 、陰性對(duì)照、空白對(duì)照的數(shù)量和，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表A.1。每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系試劑使用量終濃度PrimeScript 1 Step Enzyme Mix2 L21 Step Buffer（Dye Plus）25 L正向引物RRSV-F1 L0.4 M反向引物RRSV-R1 L0.4 MTemplate RNA1 L3 LRNase Free dH2O補(bǔ)充反應(yīng)體積至50 L循環(huán)條件設(shè)置將A.4.5.1.2中配制好反應(yīng)液的PCR管做標(biāo)記后放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放

14、順序。 循環(huán)條件設(shè)置：第一階段：50 反轉(zhuǎn)錄30 min；第二階段：94 預(yù)熱2 min；第三階段：94 預(yù)變性30 s，58 退火30 s，72 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；第四階段：72 延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)或4 條件下保存?zhèn)溆?。電泳檢測(cè)分別取PCR反應(yīng)液5 L加入預(yù)先混有Gel-red工作液的1%瓊脂糖凝膠孔中（1TAE緩沖液），電泳20 min30 min（120 V）。結(jié)果判定電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上觀察，根據(jù)DNA Marker標(biāo)記判斷擴(kuò)增的條帶大小，如果陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)樣品同時(shí)出現(xiàn)894 bp的目的擴(kuò)增條帶，而陰性對(duì)照、空白對(duì)照均不出現(xiàn)該條帶，

15、該樣品判斷為攜帶水稻齒葉矮縮病毒；如果陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增條帶894 bp，而陰性對(duì)照、空白對(duì)照及檢測(cè)樣品均不出現(xiàn)該條帶，該樣品判斷為不攜帶水稻齒葉矮縮病毒。廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)水稻品種抗水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范(征求意見(jiàn)稿)編制說(shuō)明2022年04月一、任務(wù)來(lái)源和起草單位“水稻品種抗水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范”于2017年5月被列入廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2017年第四批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定（修訂）項(xiàng)目計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)為2017-0458。 本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所負(fù)責(zé)起草編寫(xiě)。按推薦性廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定。二、目的意義水稻齒葉

16、矮縮病毒病由水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）侵染引起，是遷飛性害蟲(chóng)褐飛虱傳播的病害，近年來(lái)在廣西、廣東、福建、海南、云南及越南等東盟國(guó)家發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10% 20%, 嚴(yán)重的減產(chǎn)80%100%，且經(jīng)常與南方水稻黑條矮縮病復(fù)合感染，對(duì)水稻生產(chǎn)和糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。推廣種植抗(耐)病品種是經(jīng)濟(jì)有效的防治措施之一，但目前缺乏統(tǒng)一的抗病性鑒定技術(shù)操作規(guī)程，水稻品種對(duì)該病害的抗病性缺乏有效評(píng)價(jià)。研究制定水稻品種抗齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范，有利于開(kāi)展水稻品種抗病性鑒定工作，為進(jìn)一步挖掘抗病基因、抗病育種和病害綜合防控奠定基礎(chǔ)。對(duì)貫徹以利用抗病

17、品種為基本手段的水稻齒葉矮縮病綜合防治策略，保障我國(guó)水稻高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)、實(shí)現(xiàn)糧食安全生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。三、國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比情況據(jù)查閱，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的編制，該廣西地方標(biāo)準(zhǔn)水稻品種抗水稻齒葉矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范的編寫(xiě)對(duì)水稻品種抗病性鑒定的規(guī)范操作有重要的指導(dǎo)作用。四、編制過(guò)程1、組成編制小組，制訂工作計(jì)劃項(xiàng)目下達(dá)后，成立了編制工作小組，制定編寫(xiě)計(jì)劃，并進(jìn)行人員分工（表1）。表1 主要編制人員與責(zé)任分工秦碧霞女研究員植物病理學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所主持, 重要指標(biāo)確定，編寫(xiě)規(guī)程謝慧婷女副研究員植物病理學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)

18、研究所數(shù)據(jù)收集、編寫(xiě)崔麗賢女農(nóng)藝師農(nóng)學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證李戰(zhàn)彪男副研究員植物病理學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所資料收集蔡健和男研究員植物病理學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所數(shù)據(jù)收集陳錦清女無(wú)植物病理學(xué)廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所檢測(cè)、指標(biāo)驗(yàn)證2、收集整理資料收集整理國(guó)內(nèi)、區(qū)內(nèi)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)內(nèi)公開(kāi)發(fā)表的相關(guān)技術(shù)性資料。整理總結(jié)編制團(tuán)隊(duì)成員相關(guān)試驗(yàn)研究成果。3、確定編寫(xiě)原則根據(jù)水稻齒葉矮縮病的發(fā)生危害特點(diǎn)，結(jié)合本所主持及參加的國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)（水稻）、廣西農(nóng)科院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)等與水稻矮縮病

19、相關(guān)的研究?jī)?nèi)容及試驗(yàn)數(shù)據(jù)為制定依據(jù)，本著品種抗性鑒定“簡(jiǎn)便、實(shí)用、準(zhǔn)確、規(guī)范”的要求，就水稻品種抗水稻齒葉矮縮病鑒定方法進(jìn)行了規(guī)范。4、編寫(xiě)修改，形成征求意見(jiàn)稿參照廣西地方標(biāo)準(zhǔn)編制的基本格式，按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定，起草了該標(biāo)準(zhǔn)的征求意見(jiàn)稿，并通訊征求區(qū)內(nèi)外9位有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)研究、推廣、使用等不同領(lǐng)域、不同類型單位專家的意見(jiàn)，修改形成征求意見(jiàn)稿。五、標(biāo)準(zhǔn)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)依據(jù)和來(lái)源 本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性廣西地方標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定編制，參考NY/T 2955-2016水稻品種試

20、驗(yàn) 水稻黑條矮縮病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)編制小組前期研究成果、參考國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)資料并經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，確定了褐飛虱的飼毒時(shí)間、循回期、傳毒時(shí)間和接種苗齡等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，并對(duì)廣西45個(gè)主栽水稻品種進(jìn)行抗齒葉矮縮病鑒定評(píng)價(jià)，驗(yàn)證了人工接種方法的可行性，已發(fā)表論文1篇（謝慧婷等，2017），獲授權(quán)發(fā)明專利1件（ZL 2021 1 1072966.2），授權(quán)實(shí)用新型專利2件（ZL 2021 2 2741492.8，ZL 2021 2 2744411.X），已受理實(shí)用新型專利1件（202220293686.8）。褐飛虱飼毒時(shí)間的確定金登迪等（1987）研究結(jié)果表明，褐飛風(fēng)1齡2齡若蟲(chóng)飼毒48

21、h獲毒率高達(dá)62.3%，雷娟利等（1999）用1齡2齡若蟲(chóng)飼毒48h獲毒率58.6%，成功用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)齒葉矮縮病的抗性評(píng)價(jià)。謝慧婷等（2017）用低齡褐飛虱若蟲(chóng)飼毒2d3d，帶毒率達(dá)63.6%100%，成功用于廣西主栽水稻品種抗病性測(cè)定。試驗(yàn)用1齡2齡褐飛虱無(wú)毒若蟲(chóng)，分別在病株上取食12、24、48、72h后轉(zhuǎn)移至健康水稻苗度過(guò)循回期，用于接種2葉期TN1水稻苗，接種后將水稻苗移栽至防蟲(chóng)網(wǎng)室觀察，正常水肥管理，25d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，每7d調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的發(fā)病率。發(fā)病情況見(jiàn)表2，綜合參考文獻(xiàn)、試驗(yàn)結(jié)果、接種的可操作性及效率，確定褐飛虱飼毒時(shí)間為48h（2d）。表2

22、 褐飛虱不同飼毒時(shí)間接種水稻品種TN1的發(fā)病率飼毒時(shí)間總株數(shù)病株發(fā)病率（%）12h281346.4324h261453.0548h302066.6772h282589.29病毒循回期時(shí)間確定 金登迪等（1987）研究結(jié)果表明，褐飛虱體內(nèi)病毒循回期最短5天，最長(zhǎng)18天，平均8.3天，其中5天8天的占81.8%。謝慧婷等（2017）參照金登迪等研究結(jié)果對(duì)主栽水稻品種進(jìn)行抗齒葉矮縮病鑒定，明確了主栽水稻品種對(duì)齒葉矮縮病的抗性，取得滿意結(jié)果。試驗(yàn)取1齡2齡無(wú)毒若蟲(chóng)在病株上飼毒2d，之后轉(zhuǎn)移至健康水稻苗上飼養(yǎng)，第6、7、8、9、10d分別用于接種2葉期TN1水稻苗，接種后將水稻苗移栽至防蟲(chóng)網(wǎng)室觀察，正常

23、水肥管理，25d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，每7d調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的發(fā)病率。發(fā)病情況見(jiàn)表3，循回期8d、9d和10d發(fā)病率分別為74.07%、82.76%和96.43%，綜合參考文獻(xiàn)、試驗(yàn)結(jié)果、接種的可操作性及效率，確定病毒循回期為8d11d。表3不同循回期褐飛虱接種水稻品種TN1的發(fā)病率循回期時(shí)間總株數(shù)病株發(fā)病率（%）6d301446.677d281864.298d272074.079d292482.7610d282796.433、褐飛虱傳毒時(shí)間的確定金登迪等（1987）研究結(jié)果表明，褐飛風(fēng)傳毒時(shí)間最短為0.5h，傳毒率為2.6%，傳毒率隨傳毒時(shí)間延長(zhǎng)有所遞增，24h的傳毒率達(dá)40

24、.4%。雷娟利等（1999）、謝慧婷等（2017）用飼毒48h的帶毒褐飛虱接種48h的方法分別完成了轉(zhuǎn)基因水稻和主栽水稻品種對(duì)齒葉矮縮病的抗性評(píng)價(jià)。取已飼毒且度過(guò)循回期的褐飛虱，接種2葉期TN1水稻苗，傳毒時(shí)長(zhǎng)設(shè)12、24、48和72h 4個(gè)時(shí)間段，到設(shè)定時(shí)間后移出白背飛虱，將水稻苗移栽至防蟲(chóng)網(wǎng)室觀察，正常水肥管理，25d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，每7d調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的發(fā)病率。發(fā)病情況見(jiàn)表4，傳毒48h和72h，發(fā)病率分別為90%和100%，綜合參考文獻(xiàn)和試驗(yàn)結(jié)果，確定褐飛虱傳毒時(shí)間為48h。表4褐飛虱不同傳毒時(shí)間接種水稻品種TN1的發(fā)病率傳毒時(shí)間總株數(shù)病株發(fā)病率（%）12h28

25、1242.8624h281864.2948h302790.0072h26261004、水稻接種苗齡確定謝慧婷等（2017）對(duì)主栽品種1.5葉2.5葉齡期進(jìn)行苗期抗病性鑒定，明確了主栽品種的抗病性，結(jié)果符合預(yù)期。試驗(yàn)設(shè)1、2、3葉期（品種：TN1）共3個(gè)處理，按有效接種蟲(chóng)量2頭/苗接入度過(guò)循回期的褐飛虱，接種2d后移栽至防蟲(chóng)網(wǎng)室觀察，正常水肥管理，25d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，每7d調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的發(fā)病率。發(fā)病情況見(jiàn)表4，結(jié)果表明，1葉期至3葉期苗齡水稻發(fā)病率為96.42%100.00%，綜合考慮接種便捷性和接種工作效率，接種水稻苗齡確定為1.5葉-2.5葉齡期。表5 褐飛虱接種

26、不同生育期水稻品種TN1的發(fā)病率生育期總株數(shù)病株發(fā)病率（%）1葉期2828100.002葉期 3030100.003葉期282796.425、有效接種蟲(chóng)量的確定雷娟利對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行水稻齒葉矮縮病抗性評(píng)價(jià)，用帶毒蟲(chóng)進(jìn)行攻毒接種，每苗2蟲(chóng)，接種2d，獲得幾個(gè)抗性較好的水稻轉(zhuǎn)基因系；謝慧婷等對(duì)廣西水稻主栽品種進(jìn)行抗病性測(cè)定，按平均每苗有效接種蟲(chóng)量1頭-1.5頭，接種2d，明確了主栽品種的抗病性，結(jié)果符合預(yù)期。有效接種蟲(chóng)量=接種蟲(chóng)量帶毒率，設(shè)有效接蟲(chóng)量0.5、1、1.5、2、2.5、3頭/株6個(gè)處理，重復(fù)3次。于TN1水稻苗2.5葉齡期，接入度過(guò)循回期的帶毒褐飛虱成蟲(chóng)， 2d后移走褐飛虱，將水稻苗移

27、栽至防蟲(chóng)網(wǎng)室觀察，正常水肥管理。25d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，每7d調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的發(fā)病率。發(fā)病情況見(jiàn)表6。隨著有效接種蟲(chóng)量的增加，TN1的發(fā)病率有所提高，當(dāng)有效接種蟲(chóng)量為1頭/株2頭/株時(shí)，TN1的發(fā)病率為82.76%96.43%，達(dá)到預(yù)期發(fā)病率，綜合考慮介體的使用效率和抗病接種實(shí)際需要，有效接種蟲(chóng)量確定為1頭/株2頭/株。表6 不同有效接種蟲(chóng)量下水稻品種TN1的發(fā)病率有效接種蟲(chóng)量（頭/株）總株數(shù)病株發(fā)病率（%）0.5301860.001292482.761.5302790.002282796.432.5302996.6732626100.006、抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

28、參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)水稻品種試驗(yàn) 水稻黑條矮縮病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程（NY/T 2955-2016）。六、自我承諾 編制的地方標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)指標(biāo)不低于強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)技術(shù)要求，與有關(guān)的推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)不相沖突。七、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的措施與建議建議由廣西質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局會(huì)同有關(guān)部門(mén)組織該標(biāo)準(zhǔn)的貫徹實(shí)施。地方政府相關(guān)職能部門(mén)與研究單位應(yīng)強(qiáng)化對(duì)抗水稻齒葉矮縮病水稻品種的審定、推廣的行政管理與技術(shù)指導(dǎo)。參考文獻(xiàn)丁新倫，謝荔巖，潘賢，吳祖建*. .水稻齒葉矮縮病毒Pns10 蛋白的原核表達(dá)、抗血清制備及初步應(yīng)用J. 激光生物學(xué)報(bào)，2012，21（6）：546-550.江建云，柳桂秋，吳美伍，雷惠質(zhì).褐飛虱的群體飼養(yǎng)方法J.應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，1987. 48( 5) : 1314-1320.金登迪，林瑞芬，余艦斌. 水稻齒葉矮縮病的潛育期及介體褐稻虱的傳毒特性J. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1987，（5）：236-237.雷娟利，呂永平，金登迪，陳劍平，陳聲祥*轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)水稻齒葉矮縮病毒（RRSV）抗性評(píng)價(jià)J. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，11（5）:217-222雷娟利，呂永平，金登迪，陳聲祥，陳劍平*.應(yīng)用RT-PCR