微生物制藥工藝學(xué)(發(fā)酵工藝設(shè)計與優(yōu)化)0706課件

1、 微生物制藥工藝學(xué)發(fā)酵過程工藝設(shè)計與優(yōu)化重慶大新藥業(yè)股份有限公司 研發(fā)中心 郭明2007年6月需要解決的四個問題工藝流程設(shè)計（種子擴大級數(shù)）工藝參數(shù)設(shè)計（種齡、種量、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣比、pH控制、泡沫控制、補料策略、攪拌與罐體設(shè)計等等）染菌的防治工藝參數(shù)的優(yōu)化典型的發(fā)酵工藝流程圖種子制備種子擴大培養(yǎng)的目的與要求如何確定種子擴大培養(yǎng)級數(shù)各級種子的質(zhì)量標準制定（種齡、菌絲形態(tài)、 pH、菌濃等）可能出現(xiàn)的問題及解決措施種子擴大培養(yǎng)的目的與要求 種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這

2、些純種培養(yǎng)物稱為種子。 純種、合適的量、適宜的種齡、健壯是實現(xiàn)代謝產(chǎn)物最經(jīng)濟生產(chǎn)的基礎(chǔ)！ 如何確定進罐種子的方式？ 實驗室種子的制備一般采用兩種方式對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法，采用菌絲體接種。孢子的制備： 孢子產(chǎn)生條件：干燥、營養(yǎng)缺乏、成熟期產(chǎn)生 孢子檢測：壓片法，顯微觀察 細菌孢子制備：限制碳源，使氮源豐富，培養(yǎng)溫度37，時間2天左右，產(chǎn)芽孢桿菌時間約長。 放線菌孢子制備：放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的

3、營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28C。培養(yǎng)時間為514天； 霉菌孢子的制備：霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為2528C。培養(yǎng)時間一般為414天液體種子（菌絲體）的制備 好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S. Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子（可來自于斜面、凍存管、凍干管）或菌絲體（來自于液氮保存管）接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 試管（凍存管、冷凍管、液氮凍

4、存管等）三角搖瓶振蕩培養(yǎng)種子罐 厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 試管三角瓶卡式罐種子罐搖瓶種子菌絲搖瓶種子菌絲如何確定種子的培養(yǎng)級數(shù)種子罐的作用：主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌絲，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于： （1) 菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； (2) 所采用發(fā)酵罐的容積。細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁

5、殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，一般三級，甚至采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 確定種子罐級數(shù)需注意的問題：種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 種子的質(zhì)量及其影響因素種子的質(zhì)量標準：菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； 生理形狀穩(wěn)定； 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染； 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

6、種子質(zhì)量檢測指標：pH；菌種的數(shù)量 培養(yǎng)基滅菌前后磷、糖、氨基氮的含量；菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）；其他參數(shù)，如接前抗生素含量、某種酶活力等。影響種子質(zhì)量的因素：原料質(zhì)量和培養(yǎng)基：培養(yǎng)條件斜面冷藏時間染菌原材料質(zhì)量與培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。 原材料質(zhì)量的波動，起主要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。以培養(yǎng)菌體為目的，種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分一致較好。影響種子質(zhì)量的因素培養(yǎng)條件：（1）溫度 溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。主要影

7、響酶反應(yīng)和生命運動。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴格控制孢子斜面的培養(yǎng)溫度。2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。（3）pH：主要是H對微生物生命活動的影響。（4）通氣量與攪拌： 微生物不同階段對氧的需求是不同的，通常在種子擴培過程中，前期需氧量大，后期較小。攪拌有利于傳質(zhì)，傳氧。但不可過于劇烈。 例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵

8、有利。出發(fā)菌種保存時間：斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏78天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6 C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。如何防治種子培養(yǎng)、移種過程的染菌？無菌室要求：基本功 種子接種過程： 熟練、規(guī)范。生產(chǎn)中常出現(xiàn)的問題及解決措施菌種生長速度: 過快或過慢 菌絲結(jié)團菌絲粘壁種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次

9、是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。 菌種穩(wěn)定性的檢查無菌（雜菌）檢查發(fā)酵工藝設(shè)計要解決的問題 1.工藝的選擇（分批、半連續(xù)、連續(xù)培養(yǎng)） 2.培養(yǎng)基滅菌方式的選擇 3.移種方式的選擇 4.發(fā)酵工藝參數(shù)的選擇 溫度、攪拌葉設(shè)計及攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓與通氣比（溶氧）、pH調(diào)節(jié)與補料、泡沫控制、染 菌防治等等工藝選擇 分批、半連續(xù)、連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)缺點分批發(fā)酵：優(yōu)點是操作簡單、周期短、染菌機會少、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點是產(chǎn)率低，設(shè)備利用率低。補料分批培養(yǎng)與半連續(xù)：這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用

10、計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。由于沒有物料取出或取出其中的一部分，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機會。連續(xù)培養(yǎng)：優(yōu)點是控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。由于D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動力學(xué)。缺點 菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。培養(yǎng)基滅菌方式滅菌的原因：在發(fā)酵過程中如混入其他微生物，將與菌種形成競爭關(guān)系，對發(fā)酵過程造成不良影響 。舉例：如果在谷氨酸發(fā)酵過程中混人放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡。如果在青霉素生產(chǎn)過程中污染了雜菌，

11、這些雜菌則會分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。 滅菌方式： 熱滅菌（干熱滅菌、濕熱滅菌）、化學(xué)滅菌、輻射滅菌、過濾除菌等。培養(yǎng)基熱滅菌 連消（連續(xù)滅菌） 實消（實罐滅菌) 滅菌原則：控制滅菌溫度與時間，既達到無菌要求，又使營養(yǎng)成分破壞減少到最低。移種方式從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 從種子罐接種接種齡與種量種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一

12、般需經(jīng)過多種實驗來確定。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。 接種量： 基于實驗室搖瓶試驗結(jié)果，判定過小、過大的接種量對發(fā)酵指標的影響。 移入種子的體積 接種量 接種后培養(yǎng)液的體積 過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素種子罐到發(fā)酵罐為7-15%。但是一般認為大一點好。搖瓶菌絲種子液進入種子罐一般為0.2-1%。 雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。 倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。發(fā)酵工藝設(shè)計發(fā)酵工藝控制參數(shù)；發(fā)酵的中間控制的項目包括：溫度控制、pH控制、泡沫控制、補料控制、溶氧的控制、染菌控制； 工藝執(zhí)行上表現(xiàn)在： 溫度調(diào)節(jié)； 攪拌漿型式與攪拌轉(zhuǎn)速； 空氣流

13、量與罐壓調(diào)節(jié)； pH調(diào)節(jié)； 補料策略；工藝控制依據(jù)：過程菌絲或細胞形態(tài)、營養(yǎng)代謝與產(chǎn)物形成等。發(fā)酵工藝參數(shù)溫度： 不同微生物的生長對溫度的要求不同，根據(jù)它們對溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應(yīng)于026 生長，嗜溫菌適應(yīng)于1543 生長，嗜熱菌適應(yīng)于3765生長，嗜高溫菌適應(yīng)于65 以上生長溫度的影響（1）產(chǎn)熱： 生物熱Q生物） 、摩擦熱Q攪拌 散熱： 蒸發(fā)熱Q蒸發(fā) 、輻射熱Q輻射 Q發(fā)酵 = Q生物 + Q攪拌 - Q蒸發(fā) - Q輻射 酶學(xué)方面：在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高，反應(yīng)速率加大，有利于菌體生長和產(chǎn)物積累，但菌體的衰退也加快，菌體對氧的消耗相應(yīng)加快，而溫度升高時，氧的溶解度下降，所以應(yīng)

14、綜合考慮。溫度的影響（2）產(chǎn)物方面：溫度能影響菌體分泌的產(chǎn)物種類及酶系。用米曲霉制曲時，如溫度在低限時，得到蛋白酶，此時-淀粉酶的合成受到抑制。又如用凝結(jié)芽孢桿菌合成-淀粉酶時，發(fā)酵溫度控制在55時，合成的-淀粉酶較耐高溫，在90、60min條件下，其活性喪失僅10左右，而發(fā)酵溫度控制在35時，合成的-淀粉酶在相同條件下喪失90。菌體特性方面：同種菌體在生長和產(chǎn)物積累階段所要求的溫度往往有差別，多數(shù)情況下是最適生長溫度比產(chǎn)物積累的最適溫度要略高些。攪拌與通氣 原則：高溶氧、低剪切溶氧濃度的變化溶氧濃度的控制 需氧因素：菌體濃度、遺傳因素、菌齡、營養(yǎng)成分與濃度、有害物質(zhì)的積累、培養(yǎng)條件。 供氧因

15、素： KLa與初始氧濃度 影響KLa因素：提高攪拌，增加通氣量調(diào)節(jié)kla的效果顯著。CL臨界氧溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物形成的影響CCrQO2CLCCrCCr: 臨界溶氧濃度, 指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。一般對于微生物： CCr: 115%飽和濃度考慮氧傳遞與剪切，追求高溶氧、低剪切。傳統(tǒng)型式：箭葉、彎葉、直葉新型：半圓葉、螺旋槳葉，增加軸向流。攪拌發(fā)酵工藝參數(shù)pHpH值對菌體生長和代謝產(chǎn)物形成的影響 影響微生物活動環(huán)境的離子強度、細胞膜的透性及膜上的帶電性和氧化-還原電位、酶活性。如黑曲霉在酸性（pH23）時，進行檸檬酸發(fā)酵，而在接近中性時，則進行草酸發(fā)酵。發(fā)酵過程中pH值的調(diào)節(jié)及控

16、制 調(diào)整培養(yǎng)基組分 在發(fā)酵過程中進行控制，根據(jù)發(fā)酵液pH值的變化，進行相應(yīng)補料控制發(fā)酵工藝參數(shù)補料： 補料的意義、內(nèi)容、原則 意義：補充菌體營養(yǎng)，延長發(fā)酵期（推遲自溶期），提高發(fā)酵產(chǎn)量； 內(nèi)容：補充C源、N源、無機鹽、誘導(dǎo)酶的底物； 原則：根據(jù)菌體生長代謝規(guī)律；生產(chǎn)需要；補料操作 時間：為達到生產(chǎn)目的，在需要時加入； 方式：以不引起發(fā)酵液成分劇烈波動為前提； 補量：加入與消耗平衡；前體補加-四兩撥千斤抗生素被抑制的產(chǎn)物抑制劑鏈霉素去甲基鏈霉素四環(huán)素去甲基金霉素頭孢菌素C利福霉素甘露糖鏈霉素鏈霉素金霉素金霉素頭孢霉素N其他利福霉素甘露聚糖乙硫氨酸溴化物、硫脲硫胺化合物L-蛋氨酸巴比妥藥物菌絲形態(tài)

17、表征生長與代謝菌絲生長過程不同緊密程度的菌團松散的菌絲由于傳質(zhì)阻力小，底物供應(yīng)充分，能快速生長，大量分枝，它們的代謝主要支持生長，屬于初級代謝，其利用速率要高于底物限制下的情況證據(jù)：菌絲發(fā)散情況下CER、OUR要遠高于一般批次不同轉(zhuǎn)速對前期菌絲生長影響18h 600rpm18h 300 rpm菌絲自溶在菌絲即將自溶時，結(jié)束發(fā)酵在發(fā)酵過程中，嚴格防止菌絲自溶泡沫影響與控制泡沫的產(chǎn)生、性質(zhì)及變化 泡沫實際上是氣溶膠構(gòu)成的膠體系統(tǒng)，其分散相是空氣和代謝氣，連續(xù)相是發(fā)酵液，泡沫間隔著一層液膜而被彼此分開不相連通。泡沫對發(fā)酵的影響 減少發(fā)酵的有效容積，若不加控制，過多的泡沫通過 排氣管溢 出，造成發(fā)酵液

18、流失； 過多的泡沫可能從罐頂?shù)妮S封滲出罐外，這就增加了染菌的機會； 使部分菌體粘附在罐蓋或罐壁上，而失去作用； 泡沫嚴重時，影響通氣攪拌的正常進行，妨礙代謝氣的排出，對菌體呼吸造成影響，甚至使菌體代謝異常，影響生產(chǎn)率。泡沫的控制：化學(xué)消泡、機械消泡?；瘜W(xué)消泡劑消泡劑選用依據(jù)： 表面活性劑，具有較低的表面張力（內(nèi)聚力弱），消泡效果明顯。 對氣-液界面的散布系數(shù)必須足夠大，才能迅速消泡； 無毒害性，且不影響發(fā)酵菌體； 不干擾各種測量儀表的使用； 在水中的溶解度較小，以保持持久的消泡性能； 來源方便，使用成本低；常用的一些消泡劑：天然油脂；高碳醇、脂肪酸和酯類；聚醚類；硅酮類；應(yīng)用：在消泡劑的使用時

19、主要是讓其有足夠的分散性能，除用機械方式協(xié)助其擴散外，還用載體以助其分散，具體使用有以下幾種形式： 消泡劑 + 載體； 復(fù)合消泡劑； 消泡劑 + 乳化劑染菌控制日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透 0.79總空氣系統(tǒng)有菌 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89接種管穿孔 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設(shè)備滲漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94無菌空氣處理系統(tǒng)空壓機儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾噬菌體污染防治是微

20、生物制藥過程的重要工作之一電動機pH檢測及控制裝置培養(yǎng)液無菌空氣排氣口冷卻水出口冷卻水進口攪拌器加料口放料口發(fā)酵罐示意圖發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化發(fā)酵工藝優(yōu)化目的提高產(chǎn)量減少副產(chǎn)物產(chǎn)生節(jié)能發(fā)酵工藝優(yōu)化研究手段代表性的發(fā)酵生產(chǎn)工藝介紹從自然界分離的菌種產(chǎn) 品基因工程誘變育種誘變育種生產(chǎn)用菌種擴大培養(yǎng)原 料微生物菌體代謝產(chǎn)物分離提純發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制接種培養(yǎng)基配置滅菌通過參數(shù)優(yōu)化工藝，優(yōu)化后的工藝通過參數(shù)驗證參數(shù)(變量)分類直接參數(shù): 物理參數(shù)，如溫度、通氣流量、攪拌轉(zhuǎn)速、 化學(xué)參數(shù),如DO、pH、排氣02、CO2 生物量參數(shù) ，菌量，OD 間接參數(shù): 由一些直接參數(shù)計標得到的各種反映過程特性 的參數(shù)。如

21、OUR,CER,RQ手工參數(shù): 取樣后實驗室手工測量參數(shù)，離線輸入。工藝優(yōu)化的手段基于發(fā)酵過程各參數(shù)和代謝物生化合成途徑進行相關(guān)分析，找到影響代謝物積累的敏感因素，進行多尺度干預(yù)。發(fā)酵過程參數(shù)檢測的多樣性、準確性是實現(xiàn)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)。工藝優(yōu)化一般通過培養(yǎng)基改進、溫度、pH、攪拌、通風、補料等方式實現(xiàn)。試驗多批次，結(jié)論更可靠。補糖與pH相關(guān)圖發(fā)酵工藝優(yōu)化實例紅霉素發(fā)酵過程優(yōu)化研究 中國工程科學(xué)2001年，8期DO-發(fā)酵液中溶解氧濃度、OUR-菌體代謝耗氧速率、CER-二氧化碳釋放速率、RQ-呼吸商-代謝途徑、KLa-生物反應(yīng)器中氧傳遞速率、pH酸堿度、菌體濃度、等40多個參數(shù)9-25小時之間 RQ（CER/OUR）呈低谷狀 必需限制補葡萄糖生物相關(guān)：OUR、 CER、 RQ值相關(guān)生物相關(guān)：加入葡萄糖對RQ的影響還原性較高的基質(zhì)作碳