手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷課件

1、04 十月 2022手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷02 十月 2022手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷手足口病的病原手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）由人腸道病毒感染引起。人腸道病毒為小RNA病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Enterovirus）的一組單股正鏈RNA病毒。其中包括?？刹《荆?1個(gè)血清型）、柯薩奇病毒A組（23個(gè)血清型）和B組（5個(gè)血清型），還包括3個(gè)脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型和人腸道病毒68-71型。 2手足口病的病原手足口?。╤and-foot-mouth diCourtesy of Linda M. Stannard, University of

2、Cape Town, S.A.h30nm二十面體對(duì)稱無包膜人腸道病毒的毒粒結(jié)構(gòu)3Courtesy of Linda M. Stannard,人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。柯薩奇病毒：1948年在美國(guó)紐約Coxsackie鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標(biāo)本接種至乳鼠體內(nèi)，分離出來的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們?cè)谌槭笊袭a(chǎn)生的組織病理學(xué)變化和在細(xì)胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。?？刹《荆?951年在一名無癥狀的兒童的糞便標(biāo)本中分離到，在細(xì)胞培養(yǎng)上可以造成致細(xì)胞病變，但對(duì)乳鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物不致病。新腸

3、道病毒：隨后新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號(hào)命名（6971），最近，已經(jīng)命名至102型4人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病腸道病毒主要血清型5腸道病毒主要血清型5手足口病的常見致病病原多種腸道病毒都可引起HFMD，主要為：柯薩奇病毒A組的47、9、10、16型B組的13、5型埃可病毒的部分血清型腸道病毒71型 最常見的為CV-A16和EV71 6手足口病的常見致病病原多種腸道病毒都可引起HFMD，主要為：腸道病毒的抵抗力腸道病毒無包膜，乙醚、75%酒精、表面活性劑等均不能將其滅活。對(duì)紫外線及干燥敏感；各種氧化劑（高錳酸鉀、漂白粉等）、甲醛或56 30min都能滅活病毒病毒在4可

4、存活1年，-20可長(zhǎng)期保持感染性 病毒RNA有感染性。7腸道病毒的抵抗力腸道病毒無包膜，乙醚、75%酒精、表面活性劑（一）糞便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量58g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（二）腦脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原和抗體檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3日內(nèi)，采集量為1.02.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。手足口病的標(biāo)本采集8（一

5、）糞便標(biāo)本手足口病的標(biāo)本采集8手足口病的標(biāo)本采集（三）血清標(biāo)本 采集急性期(發(fā)病05天)和恢復(fù)期(發(fā)病1430天)雙份配對(duì)血清用于抗體檢測(cè)。檢測(cè)IgM時(shí)，采集 (發(fā)病720天)血。靜脈采集35ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于20以下冰箱中冷凍保存。 （四）咽拭子標(biāo)本 采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（細(xì)胞維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。9手足

6、口病的標(biāo)本采集（三）血清標(biāo)本9（五）皰疹液可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。手足口病的標(biāo)本采集10手足口病的標(biāo)本采集10標(biāo)本采集器械要求注射器：醫(yī)用（5ml和10ml）一次性注射器棉拭子：塑料桿全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）糞便保存管：5-20 ml螺口塑料管(外螺

7、旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）-全國(guó)POLIO網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室11標(biāo)本采集器械要求注射器：醫(yī)用（5ml和10ml）一次性注射器鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）尸檢組織凍存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)；尸檢（每一個(gè)樣品換手術(shù)刀）記號(hào)筆：油性，防水標(biāo)本采集器械要求病人標(biāo)本的采集運(yùn)輸和保藏12鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)， 在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液 中分離病毒具有很高的診斷價(jià)值。 用于采集咽拭子的無菌拭子要

8、放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防干燥。標(biāo)本采集注意事項(xiàng)13 在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液 中分離標(biāo)本采集注意事項(xiàng)為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。 不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。 對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病2-4周后采集。14標(biāo)本采集注意事項(xiàng)為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行基因檢測(cè)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)抗體檢測(cè)、病毒分離和病鑒定手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷15手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行基因檢測(cè)、抗手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法病毒

9、分離抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)蛋白/核酸芯片16手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法病毒分離16標(biāo)本病毒分離CPE陽(yáng)性RT-PCR及序列測(cè)定腸道病毒非腸道病毒測(cè)雙份血清中和抗體滴度RT-PCRReal time RT-PCR檢測(cè)病毒核酸序列測(cè)定無CPE常規(guī)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中和定型手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程17標(biāo)本病毒分離CPE陽(yáng)性RT-PCR腸道病毒非腸道病毒測(cè)雙份血病毒分離培養(yǎng)用于病毒分離的標(biāo)本： 包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本適用的細(xì)胞 RD細(xì)胞（人胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞）、Hep-2細(xì)胞（人喉上皮癌細(xì)胞）18病毒分離培養(yǎng)用于病毒分離的標(biāo)本：18病毒分離培養(yǎng)標(biāo)本的處理 1、糞便：2

10、g 加PBS 10ml，振蕩混勻，1500g低溫離心20min，上清0.2ml接種敏感細(xì)胞 2、咽拭子：于采樣管中充分洗滌拭子， 4下 10000rpm離心20min，上清0.2ml接種敏感細(xì)胞 3、腦脊液和皰疹液：直接接種19病毒分離培養(yǎng)標(biāo)本的處理19病毒分離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察： 36培養(yǎng)逐日觀察，第1代培養(yǎng)見可疑CPE 至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待穩(wěn)定CPE出現(xiàn)后, - 20或- 70凍存以備進(jìn)一步鑒定； 如果7天之后沒有出現(xiàn)CPE，需盲傳2代繼續(xù)觀察，盲傳2代后仍不出現(xiàn)CPE則判定為陰性；鑒定：中和試驗(yàn)20病毒分離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察：20血清抗體檢測(cè)方法 中和實(shí)驗(yàn)、 ELISAIgM：?jiǎn)畏菅杭?/p>

11、性期IgG ：雙份血：急性期，恢復(fù)期陰轉(zhuǎn)陽(yáng)，四倍升高，四倍降低均可診斷近期感染21血清抗體檢測(cè)方法21病毒核酸檢測(cè)RT-PCR RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)用于RNA病毒的檢測(cè)，酶促催化使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄與第一次PCR在同一系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄完成后，加熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后開始PCR擴(kuò)增。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由依賴RNA的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA拷貝，后者能進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增。22病毒核酸檢測(cè)RT-PCR RT-PCR(Reverse 病毒核酸檢測(cè)RT-PCR方法特點(diǎn)：快捷、簡(jiǎn)便高度靈敏、特異具有病

12、原診斷意義高效的通用型技術(shù)平臺(tái)23病毒核酸檢測(cè)RT-PCR方法特點(diǎn)：23 糞便標(biāo)本：采用氯仿進(jìn)行處理。 肛拭子/咽拭子標(biāo)本：咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)，然后在4下，10000 rpm離心20min 。 皰疹液和腦脊液：直接用于RNA提取。標(biāo)本的預(yù)處理24 糞便標(biāo)本：采用氯仿進(jìn)行處理。標(biāo)本的預(yù)處理24可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標(biāo)本中提取病毒RNA 簡(jiǎn)化操作、規(guī)范方法、條件一致、排除干擾QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）適合臨床標(biāo)本和病毒培養(yǎng)物標(biāo)本QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT： 74104） 適合組織和咽拭子標(biāo)本

13、RNA的提取25可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標(biāo)本中提取病毒RNA RNA的提取2引 物人腸道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸檢測(cè)通用引物 PE2（上游）：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3 PE1（下游）：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3 26引 物人腸道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EVEV71核酸檢測(cè)引物序列：EV71-S（上游）：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3EV71-A（下游）：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT

14、 GC -3引 物27EV71核酸檢測(cè)引物序列：引 物27CA16核酸檢測(cè)引物序列：Cox A16-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3Cox A16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3 引 物28CA16核酸檢測(cè)引物序列：引 物28根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況建立各自RT-PCR反應(yīng)體系配下列試劑主溶液：10PCR Buffer（含Mg2+）5.0ldNTPs（2.5mM each） 2.0l上游引物（0.1g/l）1.0l下游引物（0.1g/l）1.0lRNA酶抑制劑（RNasin,40U/l） 0.5lTaq DNA聚

15、合酶（5U/l） 0.5lAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/l） 1.0l模板RNA 3.0lRNase Free dH2O 36.0l 50.0l反應(yīng)體系29根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況建立各自RT-PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：4245min953min9520s5025s 32個(gè)循環(huán) 7230s7210min 4Soak 溫度循環(huán)參數(shù)30在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：溫度循環(huán)參數(shù)通過比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。 結(jié)果解釋31通過比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置RT-PCR實(shí)

16、驗(yàn)結(jié)果解釋32RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋32實(shí)驗(yàn)室診斷原則人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應(yīng)對(duì)血清診斷及病原診斷的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果作嚴(yán)格評(píng)價(jià)，必須結(jié)合臨床癥狀及環(huán)境因素流行病學(xué)分析，以確立病毒與疾病的病原學(xué)關(guān)系。一般采取的原則為：（1）病毒分離陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于對(duì)照人群；（2）病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；（3）從病變組織中分離出病毒。33實(shí)驗(yàn)室診斷原則人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸（RT-PCR法），或分離到病毒或腸道病毒IgM陽(yáng)性，即可證明是該腸道病毒引

17、起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。從疑為死于EV71（或其它腸道病毒）的尸檢標(biāo)本中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或分離到病毒或腸道病毒IgM陽(yáng)性，即可證明是該腸道病毒是病因。從HFMD患者的皰疹液中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或分離到病毒，那么該病毒就是病因病原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義34從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測(cè)到相應(yīng)的腸實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義 當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或未分離到病毒時(shí)，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時(shí)引起無癥狀感染，只從個(gè)別HFMD患者糞便標(biāo)本中分離到EV71（或其它腸道病毒）時(shí)，不能輕易下結(jié)論EV71是病因，應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過程和流行病學(xué)資料進(jìn)行解釋。35實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義 當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離手足口病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)問題 1、實(shí)驗(yàn)室生物安全問題：必須重視的問題實(shí)驗(yàn)人員受過生物安全培訓(xùn) 有防范潛在生物危害的意識(shí) 熟悉生物安全規(guī)程，掌握生物安全技能實(shí)驗(yàn)室自己的生物安全指南合格的生物安全實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室文件化的規(guī)程及方法（包括常規(guī)的和特殊的）36手足口病檢