免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

1、第17章 免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 血清學(xué)試驗(yàn)第二節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)第17章 免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 血清學(xué)試驗(yàn)第一節(jié) 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)第一節(jié) 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)在體外鑒別抗原與抗體的試驗(yàn)通常有四個(gè)：凝集、沉淀、補(bǔ)體參與的反應(yīng)、中和反應(yīng)等.因?yàn)檫@四種基本反應(yīng)一般皆需要血清,所以體外的抗原、抗體反應(yīng)又常常被稱為血清學(xué)反應(yīng)。(serological reaction)一.血清學(xué)試驗(yàn)的類型二.血清學(xué)試驗(yàn)的一般特點(diǎn)三.血清學(xué)試驗(yàn)的優(yōu)越性四.血清學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展趨向在體外鑒別抗原與抗體的試驗(yàn)通常有四個(gè)：凝集、沉淀、補(bǔ)體參與的一.血清學(xué)試驗(yàn)的類型協(xié)同凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)中和反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)抗球蛋白實(shí)驗(yàn)環(huán)

2、狀沉淀實(shí)驗(yàn)絮狀沉淀實(shí)驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)分類經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)：一.血清學(xué)試驗(yàn)的類型協(xié)同凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)中和反應(yīng)補(bǔ)體1.凝集反應(yīng) (agglutination)細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素.凝集反應(yīng)是經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)，使用歷史悠久并一直沿用至今。1896年， Widal診斷傷寒病；1900年，Landsteriner發(fā)現(xiàn)人類血型并于1930年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)金。 1.凝集反應(yīng) (agglutination)細(xì)菌和紅細(xì)胞等 1)直接凝集反應(yīng)（以玻片法為例）

3、 顆粒性抗原(細(xì)菌,紅細(xì)胞等)直接與相應(yīng)的抗體結(jié)合,在有電解質(zhì)存在的等一定條件下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊,稱為直接凝集反應(yīng). 可以分為玻片法與試管法. 1)直接凝集反應(yīng)（以玻片法為例） 顆粒 2)間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原(抗體)吸附于適應(yīng)的載體,在一定的環(huán)境中與相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生反應(yīng)生成肉眼可見(jiàn)的凝集物. 2)間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原(可溶性抗原存在于宿主組織或體液中游離的抗原物質(zhì)?？扇苄钥乖m然是在機(jī)體感染過(guò)程中于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，但是在病毒粒子的組分中有時(shí)也包含它。它們可能是寄生蟲(chóng)的代謝產(chǎn)物；或死亡蟲(chóng)體釋放的體內(nèi)物質(zhì)；或由于寄生生活所改變的宿主物質(zhì)?？扇苄钥乖嬖谟谒拗鹘M織或體液中游離的

4、抗原物質(zhì)。2.中和反應(yīng)(neutralization)細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)。中和試驗(yàn)是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用的一種抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)方法，用以測(cè)定抗體、中和病毒感染性或細(xì)菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。能與細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體稱為抗毒素。2.中和反應(yīng)(neutralization)細(xì)菌外毒素或病毒中和試驗(yàn)可以在敏感動(dòng)物體內(nèi)(包括雞胚)，體外組織(細(xì)胞)培養(yǎng)或試管內(nèi)進(jìn)行。觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)或中和毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用；以及測(cè)定抗體的其他生物學(xué)效應(yīng)。中和作用中和試驗(yàn)可以在敏感動(dòng)

5、物體內(nèi)(包括雞胚)，體外組織(細(xì)胞)培養(yǎng)3.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所致的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(complement fixation reaction)原理: 補(bǔ)體的作用無(wú)特異性，能與任何一種Ag-Ab復(fù)合物結(jié)合；但當(dāng)Ag與Ab不相對(duì)應(yīng)時(shí)，補(bǔ)體則不被結(jié)合而游離存在。此時(shí)如在上述反應(yīng)系統(tǒng)中加入綿羊紅細(xì)胞(Ag)和溶血素(Ab)系統(tǒng)，即可與游離的補(bǔ)體結(jié)合而出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。因此，根據(jù)溶血現(xiàn)象是否產(chǎn)生，即可得知檢測(cè)系統(tǒng)中有無(wú)相應(yīng)的抗原或抗體存在。3.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所致的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(c補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)病毒補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)病毒溶血+溶血+4.沉淀反應(yīng) (precipitation)

6、沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原（細(xì)菌培養(yǎng)濾液、細(xì)胞或組織的浸出液、血清蛋白等）與相應(yīng)抗體在液相中特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，可以是類脂、多糖或蛋白質(zhì)等；抗體稱為沉淀素。在操作時(shí)，一般要稀釋抗原。4.沉淀反應(yīng) (precipitation)沉淀反應(yīng)是指可經(jīng)典方法現(xiàn)代方法環(huán)狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)單向瓊脂擴(kuò)散法雙向瓊脂擴(kuò)散法對(duì)流免疫電泳法火箭電泳法雙向免疫電泳法沉淀反應(yīng)的主要方法經(jīng)典方法環(huán)狀沉淀反應(yīng)單向瓊脂擴(kuò)散法沉淀反應(yīng)的主要方法免疫擴(kuò)散（immunodiffusion）一種抗原或抗體混合物成分的定性與定量的分析方法。通常采用凝膠作為支持介質(zhì)，讓抗原與抗體

7、混合物在介質(zhì)中互相擴(kuò)散，相互反應(yīng)形成沉淀弧線或沉淀弧帶。一種抗原或抗體混合物成分的定性與定量的分析方法。二.血清學(xué)試驗(yàn)的一般特點(diǎn)1.特異性與交叉反應(yīng)性 2.可逆性：表面的結(jié)合，有可逆性 3.定比性：比例合適，反應(yīng)才可見(jiàn)，帶現(xiàn)象。4.階段性：不可見(jiàn)-可見(jiàn)反應(yīng) 5.條件依賴性：pH6-8），溫度（37-42），電解質(zhì)二.血清學(xué)試驗(yàn)的一般特點(diǎn)1.特異性與交叉反應(yīng)性 網(wǎng)格學(xué)說(shuō)（lattice theory）抗體過(guò)?？乖^(guò)?？贵w抗體比例合適網(wǎng)格學(xué)說(shuō)（lattice theory）抗體過(guò)?？乖^(guò)剩抗體三.血清學(xué)試驗(yàn)的優(yōu)越性1、特異性強(qiáng)，敏感性高2、檢樣量少，預(yù)處理簡(jiǎn)單3、試驗(yàn)方法多，功能各異，可擇優(yōu)選用4

8、、方法簡(jiǎn)易快速5、可用于抗原或抗體的定位三.血清學(xué)試驗(yàn)的優(yōu)越性1、特異性強(qiáng)，敏感性高四.血清學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展趨向1、試驗(yàn)的微量化和自動(dòng)化2、試劑的標(biāo)準(zhǔn)化和商品化3、方法的快速簡(jiǎn)易和標(biāo)準(zhǔn)化4、試驗(yàn)的敏感、特異和精密化5、試劑盒的系列化 四.血清學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展趨向1、試驗(yàn)的微量化和自動(dòng)化第二節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)第二節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)一、概念將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上；通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。一、概念將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原二、主要的免疫標(biāo)記物類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC

9、免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測(cè)定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測(cè)定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測(cè)定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測(cè)定 二、主要的免疫標(biāo)記物類別 三、免疫標(biāo)記技術(shù)的分類按測(cè)定用途分類：免疫組化技術(shù)：用于組織切片或其他標(biāo)本中Ag或Ab的定位。 免疫測(cè)定技術(shù)：用于液體標(biāo)本中Ag或Ab的測(cè)定。按標(biāo)記物分類： 酶免疫技術(shù); 熒光免疫技術(shù); 放射免疫技術(shù); 發(fā)光免疫技術(shù); 金免疫技術(shù)。三、免疫標(biāo)記技術(shù)的分類按測(cè)定用途分類：THANK YOUSUCCESS2022

10、/10/325可編輯THANK YOUSUCCESS2022/10/22四、免疫酶技術(shù)將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體抗原反應(yīng)的特異性，也不影響酶活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，表現(xiàn)為呈色反應(yīng)。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的抗體抗原反應(yīng)。這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。四、免疫酶技術(shù)將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建免疫酶技術(shù)分為兩類： 免疫酶組織化學(xué)法或免疫酶染色法免疫酶測(cè)定法：固相免疫酶測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EL

11、ISA） 應(yīng)用最廣泛免疫酶技術(shù)分為兩類： 1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。ELISA過(guò)程：抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）；生成抗原（抗體）待測(cè)抗體（抗原）酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物；再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。待測(cè)抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)基本原理 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯（包被材料）表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性； 抗原或

12、抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； 酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在?；驹?抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載抗體的免疫原性馬血清制備的破傷風(fēng)毒素抗體的免疫原性馬血清制備的破傷風(fēng)毒素一抗和二抗一抗：可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來(lái)的。二抗：可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測(cè)一抗。當(dāng)一抗結(jié)合到底物上，就可以通過(guò)二抗檢測(cè)出來(lái)。一抗和二抗一抗：可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東1）間接

13、法1）間接法免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件 此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。 以測(cè)定抗原為例, 將特異性抗體吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合； 經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。 2）ELISA竟?fàn)幏?此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。 五、免疫熒光（Immunofluorescence）是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)

14、記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法五、免疫熒光（Immunofluorescence）是根據(jù)抗免疫熒光常用的熒光素主要有： 異硫氰酸熒光素 (FITC) ，最大吸收光譜為 490495nm ，最大發(fā)射光譜為 520530nm ，呈黃綠色熒光。 四乙基羅丹明 (RB200) ，最大吸收光譜為 570nm

15、，最大發(fā)射光譜為 595600nm ，呈明亮橙色熒光。 四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC) ，最大吸收光譜為 550nm ，最大發(fā)射光譜為 620nm ，呈橙紅色熒光。免疫熒光常用的熒光素主要有： 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件六、放射免疫測(cè)定 (RIA) 將同位分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。 此項(xiàng)技術(shù)具有靈敏度高（可檢測(cè)出 ng 至 pg 級(jí)的微量物質(zhì)）、特異性強(qiáng)（可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原）、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、測(cè)定方法易規(guī)范化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標(biāo)志物等的分析與定量測(cè)定。 RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C。 六、放射免疫測(cè)定 (RIA) 將同位分析的高靈敏度與抗原抗免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件Thanks!48Thanks!48經(jīng)常不斷地學(xué)習(xí),你就什么都知道