內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中重組表達(dá)載體的構(gòu)建-四川

1、PAGE PAGE 24內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中重組表達(dá)載體的構(gòu)建生物科學(xué) 2003 級 廖俊華指導(dǎo)教師 陳 惠 教 授摘要：以生生物化學(xué)學(xué)與分子子生物學(xué)學(xué)實驗室室克隆并并測序的的枯草芽芽孢桿菌菌C-336內(nèi)切切葡聚糖糖酶基因因（Geenbaank 登錄號號：DQQ78229544）為模模板，通通過PCCR將編編碼信號號肽的序序列去除除，然后后與pMMD188-T Vecctorr克隆載載體連接接，構(gòu)建pMDD18-T VVecttor亞亞克隆載載體。對pMDD18-T VVecttor質(zhì)質(zhì)粒先進(jìn)進(jìn)行Bggl單酶切切，回收收后再進(jìn)進(jìn)行Spph單酶切切，通過過兩次單單酶切膠膠回收內(nèi)內(nèi)切葡

2、聚聚糖酶基基因（不不含信號號肽），并構(gòu)建建巨大芽芽孢桿菌菌重組表達(dá)達(dá)載體pHECC-Ennd，將重組表表達(dá)載體體轉(zhuǎn)化到到大腸桿桿菌DHH5中。通通過對轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子進(jìn)進(jìn)行菌落落PCRR和質(zhì)粒粒的酶切切檢測證證明成功功構(gòu)建了了內(nèi)切葡葡聚糖酶酶的巨大大芽孢桿桿菌表達(dá)達(dá)載體。關(guān)鍵詞：巨巨大芽孢孢桿菌，枯枯草芽孢孢桿菌， 內(nèi)切葡葡聚糖酶酶 ，重重組表達(dá)達(dá)載體Consttrucctioon oof eeukaaryooticc Exxpreessiion Vecctorr off thee geene of enddogllucaanasse iin BBaciilluus MMegaaterriummLIA

3、O Junn-huua Biollogiicall Scciennce, Grradee 20003Direcctedd byy CChenn Huui( Proof)Abstrractt: By thee waay oof PPCR, thhe ssequuencce ccomiing froom eendoogluucannasee geene (Geenbaank No. DQQ78229544 ) in B.ssubttiliis CC-366 sttraiin aand coddingg foor tthe siggnall peeptiide of enddogllucaanass

4、e wwas remmoveed.TThe enddogllucaanasse ggenee waas cclonned andd seequeenceed iin tthe Labboraatorry oof BBiocchemmisttry andd Moolecculaar Bioologgy.TThenn thhe ggenee wiithoout thee siignaal ppepttidee seequeencee waas lligaatedd wiith thee cllonee pllasmmid pMDD18-T.Thee pMMD188-T Vecctorr waas

5、cconsstruucteed. Firrst, thhe ppasmmid wass cuutedd byy Bggl.Theen,thee paasmiid wwas cutted by Sphh.By doubble enzyyme-cutt , thee geene of enddogllucaanasse iin BB.suubtiiliss C-36 strrainn wiithoout siggnall peeptiide wass reecivved. Thhe eeukaaryooticc exprresssionn vecctorr pHHEC-Endd wass coon

6、sttrucctedd.Eveentuuallly, thee euukarryottic exppresssioon vvecttor wass trranssforrmedd innto commpettentt E.colli DDH5 . By tthe wayy off coolonny PPCR andd reestrricttionn ennzymme ddigeestiing anaalyssis, thhe eeukaaryooticc exprresssionn vecttor of thee geene of enddogllucaanasse iin BBaciillu

7、us MMegaaterriumm waas consstruucteed ssucccesffullly.Keywoordss: Baccilllus Meggateeriuum，Baccilllus subbtillis，enddogllucaanasse，eukkaryyotiic eexprresssionn veectoor纖維素酶是是一類能能夠降解解纖維素素，使之之生成纖纖維二糖糖、葡萄萄糖等一一系列酶酶的總稱稱，按各各酶功能能的不同同可以分分為內(nèi)切切葡聚糖糖酶、外外切葡聚聚糖酶和和-葡萄萄糖苷酶酶三大類類1。纖維素素被它降降解后可可轉(zhuǎn)化為為人類急急需的能能源、食食物、化化工原料料

8、，對于于人類社社會解決決食物短短缺和能能源危機(jī)機(jī)具有重重大的現(xiàn)現(xiàn)實意義義2。隨著著中性纖纖維素酶酶和堿性性纖維素素酶在棉棉織品水水洗整理理工藝及及洗滌劑劑工業(yè)中中的成功功應(yīng)用，細(xì)細(xì)菌纖維維素酶制制劑已顯顯示出良良好的使使用性能能和巨大大的經(jīng)濟(jì)濟(jì)價值3。纖維素酶成成本高以以及酶活活力低已已成為制制約纖維維素酶廣廣泛應(yīng)用用的兩大大瓶頸，因因此，構(gòu)構(gòu)建高效效表達(dá)的的基因工工程菌是是降低纖纖維素酶酶成本、提提高產(chǎn)量量的有效效手段。幾幾乎所有有已克隆隆到的纖纖維素酶酶基因都都在大腸腸桿菌中中得到了了表達(dá)，但但是都幾幾乎存在在著表達(dá)達(dá)量低、分分離提純純困難的的缺陷。而而芽孢桿桿菌因具具有獨特特的蛋白白分泌

9、系系統(tǒng)，使使得在表表達(dá)外源源蛋白的的宿主菌菌中深受受青睞。其中枯草芽孢桿菌是應(yīng)用較廣泛的一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，并且已用于商業(yè)化生產(chǎn)酶制劑，例如，Genecor 廠家就以該菌作為生產(chǎn)堿性蛋白酶的工程菌4。近年來，巨巨大芽孢孢桿菌也也在這方方面顯示示出了較較好的應(yīng)應(yīng)用前景景，與枯枯草芽孢孢桿菌相相比，巨巨大芽孢孢桿菌還還具有兩兩大優(yōu)點點：首先先是它不不具有堿堿性蛋白白酶，從從而使外外源蛋白白能很好好的表達(dá)達(dá)而不被被降解；再次是是重組質(zhì)質(zhì)粒能夠夠在宿主主菌中穩(wěn)穩(wěn)定存在在5。有很很多蛋白白已經(jīng)成成功地在巨大大芽孢桿桿菌中得得到過量量表達(dá)，如如：Ryyguss和Hiilleen6（19991）在在巨大芽

10、芽孢桿菌菌中成功功地表達(dá)達(dá)了四種種外源蛋蛋白基因因，在木木糖操作作子的調(diào)調(diào)控下，這這些基因因的表達(dá)達(dá)提高1130到到3500倍不等等，且未未發(fā)現(xiàn)蛋蛋白酶水水解情況況。目前還未見見有關(guān)在在巨大芽芽孢桿菌菌中表達(dá)達(dá)內(nèi)切葡葡聚糖酶酶的報道道，四川川農(nóng)業(yè)大大學(xué)生物物化學(xué)實實驗室通過過自行篩篩選得到到一株產(chǎn)產(chǎn)內(nèi)切葡葡聚糖酶酶的枯草草芽孢桿桿菌并克克隆到了了編碼該該酶的基基因（Gennbannk NNo. DQ77829954），擬在此此基礎(chǔ)上上構(gòu)建該該基因的的巨大芽芽孢桿菌菌表達(dá)載載體，實實現(xiàn)該基基因在巨巨大芽孢孢桿菌中中的分泌泌表達(dá)。本實驗將不含信號肽枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因與巨大芽孢桿菌

11、表達(dá)載體pHIS1525進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，使之能在表達(dá)載體自身信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)行融合表達(dá)，為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中的高效表達(dá)及基因工程菌投入生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1 材料與與方法1.1 菌菌株及載載體：本工作所使使用的菌菌株和質(zhì)質(zhì)粒見表表1。表1 實驗驗所用的的菌株及及質(zhì)粒Tab 11 Thhe sstraain andd pllasmmid useed iin tthe expperiimenntstraiin/pplassmiddCharaacteerissticcssourcceJM1099recA11 suupE444 eendAA1 hhsd

12、RR17 gyrrA966 reelA11 thhi(laac-pproAAB)FFStoreed iin tthiss laabDH5supE444laccU1669(80llacZZM155) rrecAA1Storeed iin tthiss laabpMD188-T VecctorrAmpr laccZTaKaRRa BBiottechhnollogyypHIS115255Tetr Amppr xxylRR PxxylAAMoBiTTecB3 pllasmmidpMD188-T Vecctorr inncluudinng tthe enddogllucaanasse ggenee Co

13、nsttrucctedd inn thhis labb1.2 分分子生物物學(xué)試劑劑：引物由上海海英俊生生物技術(shù)術(shù)有限公公司合成成；Bggl = 2 * ROMAN III、Sphh = 1 * ROMAN I、重組組Taqq DNNA PPolyymerrasee、dNNTP、TT4 DDNA Liggasee、pMDD18-T VVecttor購購自TaaKaRRa BBiottechhnollogyy；質(zhì)粒粒提取試試劑盒、凝凝膠回收收試劑盒盒、DNNA MMarkker = 3 * ROMAN IIII、DNNA MMarkker = 7 * ROMAN VIII、DDNA/Hinnd =

14、 3 * ROMAN IIII購購自天為為時代；氨芐青青霉素購購自上海海生工。1.3 主主要藥品品NaCl、胰胰蛋白胨胨、酵母母浸出粉粉、瓊脂脂粉、瓊瓊脂糖、0.1mol/L CaCl2、甘油（終濃度為30%）。1.4 主主要儀器器：電熱恒溫培培養(yǎng)箱、HHZQ-F全溫溫振蕩培培養(yǎng)箱、酸酸堿pHH計、TTGL-16GG臺式普普通離心心機(jī)、板板式電泳泳槽、電電熱恒溫溫水浴鍋鍋、PCCR儀、凝凝膠成像像儀等。1.5 培培養(yǎng)基、抗生素素貯存液液及瓊脂糖糖電泳緩緩沖液：LB培養(yǎng)基基：1%胰蛋白白胨，11% NNaCll，0.5%酵酵母浸出出粉，ppH7.0（用用1mool/LL的NaaOH調(diào)調(diào)PH值值）

15、；配配制固體體培養(yǎng)基基時需加加入1.5%-2.00%的瓊瓊脂粉；配制抗抗生素培培養(yǎng)基時時需加入入氨芐青青霉素（終終濃度為為1000g/mL）。氨芐青霉素素（Ammp）貯貯存液7：1000gg/mLL（溶于于雙蒸水水中），過過濾除菌菌，小份份分裝（11mL/份）后后，-220保保存。瓊脂糖電泳泳緩沖液液8：5TTBE貯貯存液：54gg Trris堿堿，277.5gg硼酸，220mLL 0.5mool/LL EDDTA（ppH8.0），溶溶于1LL去離子子水，用用時稀釋釋10倍倍。0.55moll/L EDTTA（ppH8.0）：將1886.11g二水水乙二胺胺四乙酸酸（EDDTA-Na.2H22

16、O）加加入8000mLL水中，用用磁力攪攪拌器劇劇烈攪拌拌，用NNaOHH調(diào)節(jié)ppH至88.0，定定容至11L。0.77%的瓊瓊脂糖凝凝膠：稱稱取0.7g瓊瓊脂糖于于1000 mLL 0.5TTBE中中，用微微波爐加加熱置溶溶液澄清清為止，然然后加入入5LL的Goold Vieew核酸酸染料，混混勻即可可用。1.6 方方法.1.6.11 引物的的設(shè)計：根據(jù)已經(jīng)克克隆并測測序的內(nèi)內(nèi)切葡聚聚糖酶基基因（Gennbannk 登登錄號：DQ77829954），結(jié)合合信號肽肽預(yù)測結(jié)結(jié)果，應(yīng)應(yīng)用Prrimeer ppremmierr5.00軟件設(shè)設(shè)計一對對引物，使使其通過過PCRR去掉該該基因自自身信號號

17、肽編碼碼序列，同時加加入適當(dāng)當(dāng)?shù)拿盖星形稽c（Bgl = 2 * ROMAN II、Sph = 1 * ROMAN I），使其能夠通過連接將該基因置于表達(dá)載體信號肽編碼序列之后（表達(dá)載體pHIS1525的多克隆位點序列如圖1），且保證正確的閱讀框。已經(jīng)預(yù)測的枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶蛋白序列信號肽切割位點在29位和30位氨基酸殘基之間，成熟蛋白為470氨基酸多肽，因此設(shè)計引物如下：上游引物（PP1）：5AAGATTCTCCAGCAAGAGGACAAAAAAACGGCCAAGT 3下游引物（PP2）：5GGCATTGCCCTAAATTTTGGTTTCTTGTTTCCCCCAAA 3下劃線是引

18、引入的酶酶切位點點，分別別是Bggl、Sphh；A是是為了不不改變閱閱讀框而而引入的的堿基。圖1 pHHIS115255的多克克隆位點點序列Fig1 Seequeencee off thhe mmulttiplle cclonningg siitess(MCCS)oof ppHISS152251.6.22 目的基基因的獲獲得： B3質(zhì)質(zhì)粒的提提取及其其PCRR接種一環(huán)BB3菌株株于100mL LB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基中，3372200rr/miin培養(yǎng)養(yǎng)過夜，用用質(zhì)粒提提取試劑劑盒按操操作說明明提取BB3質(zhì)粒粒9。以提提取的BB3質(zhì)粒粒為模板板根據(jù)設(shè)設(shè)計合成成的引物物進(jìn)行PPCR10，通過過PCRR

19、獲得目目的基因因，其反反應(yīng)體系系如表22：表2 PCCR反應(yīng)應(yīng)體系Tablee 2 Coompoosittionn off PCCR試劑名稱 用量ddH2OO 32.5L10PCCR bbufffer 5.0LL25mmool/LL MggCl22 2.0LLP1 1.0LL P2 1.0LLdNTP mixxturre 6.0LL模板DNAA 2.0LL Taqq 聚合合酶 0.5LLTotall voolumme50.0L按上述順序序加入各各組分后后混合均均勻，PPCR反反應(yīng)參數(shù)數(shù)為：994預(yù)預(yù)變性22 miin，994變變性1mmin，665退退火1mmin，772延延伸900s，330

20、個循循環(huán)后，772再再延伸110miin，44保存存。反應(yīng)應(yīng)結(jié)束后后取3LPCCR產(chǎn)物物進(jìn)行00.7%瓊脂糖糖凝膠電電泳檢測測。 PCRR產(chǎn)物的的純化由于克隆需需要的DDNA片片段需要要較高的的純度，PPCR產(chǎn)產(chǎn)物需經(jīng)經(jīng)過瓊脂脂糖凝膠膠電泳充充分分離離后，利利用普通通瓊脂糖糖凝膠DDNA回回收試劑劑盒從凝凝膠中回回收目的的DNAA片段11。1.6.33 目的基基因的克克隆: 大腸桿桿菌JMM1099（或DDH5）感受受態(tài)細(xì)胞胞的制備備：參照分分子克隆隆試驗指指南（第第三版），采采用氯化化鈣法制制備大腸腸桿菌感感受態(tài)細(xì)細(xì)胞，具具體方法法如下：挑取一環(huán)EE.cooli JM1109（或或DH55）

21、菌菌株在LLB平板板上劃線線37培養(yǎng)后后，挑取單菌菌落轉(zhuǎn)到到10mmL LLB液體體培養(yǎng)基基中，3372200rr/miin培養(yǎng)養(yǎng)過夜；將上述培養(yǎng)養(yǎng)液按22%接種種量接種種到500mL LB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基中3372200rr/miin振蕩蕩培養(yǎng)22-3小時時；將培養(yǎng)后的的菌液置置冰浴中中10mmin后后轉(zhuǎn)移到到無菌的的50mmL離心心管中，4440000rr/miin離心心10mmin，去去掉上清清液，將將管倒置置1miin使痕痕量培養(yǎng)養(yǎng)液流盡盡；向管中加入入20mmL無菌菌的預(yù)冷冷的0.1mool/LLCaCCl2溶液重重新懸浮浮菌體，4440000rr/miin離心心10 minn，去掉掉

22、上清液液；向管中加入入2mLL無菌的的預(yù)冷的的0.11moll/LCCaCll2溶液重重新懸浮浮菌體；剛做的感受受態(tài)細(xì)胞胞可直接接用于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化試驗驗，也可可將剩余余的感受受態(tài)細(xì)胞胞加入終終濃度為為30%的甘油油分裝于于1.55mL離離心管（100L/管）置-70保存。 連接與與轉(zhuǎn)化.1 連連接：（連連接體系系12如表3）表3 目的的基因與與pMDD18-T VVecttor克克隆載體體的連接接體系Tablee 3 Thhe lligaatioon ssysttermm試劑名稱 用量膠回收PCCR產(chǎn)物物 5 LLpMD188-T Vecctorr 1 LL Ligaatioon MMix 4 LL

23、Totall voolumme10L將該反應(yīng)管管置PCCR儀116保保溫3 h。.2 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化：（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化方法法13如下所所述）取裝有1000LL E.colli JJM1009感受受態(tài)細(xì)胞胞的1.5mLL離心管管一支，置置冰浴中中解凍；將上述連接接好的連連接液全全部加入入到上述述離心管管中，并并用加樣樣器輕輕輕混合均均勻；將離心管放放置冰浴浴中靜置置30mmin；30 miin后將將離心管管放置442恒恒溫水浴浴中靜置置2miin；迅速將離心心管置冰冰浴中靜靜置5mmin；向離心管中中加入8890L LLB液體體培養(yǎng)基基置377培養(yǎng)養(yǎng)箱培養(yǎng)養(yǎng)90mmin，使使細(xì)菌復(fù)復(fù)蘇并表表達(dá)質(zhì)粒粒編碼的的抗生

24、素素抗性標(biāo)標(biāo)記基因因；取培養(yǎng)后的的菌液2200L用玻玻棒涂布布在含有有1000g/mL氨氨芐青霉霉素的LLB平板板上，將將平板置置37直至液液體被吸吸收后將將平板倒倒置繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)112-16 h后可可出現(xiàn)菌菌落。陽性性克隆菌菌株的篩篩選及鑒鑒定將涂布在抗抗性平板板上長出出的菌落落，挑取大大小適中中的單菌菌落進(jìn)行行菌落PPCR鑒鑒定，反反應(yīng)體系系如表22。按表2所所述體系系先加入入各組分分液體后后混勻，再分裝在0.2mLPCR管中，每管裝25L，最后用牙簽挑取適量的單菌落作為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為同所述，有一點不同就是：94預(yù)變性需5 min。反應(yīng)結(jié)束后取3LPCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳

25、檢測，能夠擴(kuò)增出與目的基因大小一致的DNA片段初步認(rèn)為是陽性克隆菌株。陽性克隆菌菌株的鑒鑒定14：將初初步篩選選得到的的陽性菌菌株分別別接種110mLLLB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基3772000r/minn培養(yǎng)過過夜，用用質(zhì)粒提提取試劑劑盒提取取質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行酶切切鑒定，酶切體系如表4和表5。表4 單酶酶切 表5 雙酶切切Tablee 4 Siinglle EEnzyyme-cutt meethood Taablee 5 Dooublle EEnzyyme-cutt meethood試劑名稱 用量試劑名稱 用量10H buffferr 1.00 L10H buffferr 1.00 L質(zhì)粒DNAA 4.00

26、 L質(zhì)粒DNAA 4.00 LBgl/Sphh 0.5 LBgl、Sphh各0.5 L ddHH2O 4.5 L ddHH2O 4.0LLTotall voolumme10.0LTotall voolumme10.0L將上述反應(yīng)應(yīng)體系置置37恒溫培培養(yǎng)箱酶酶切過夜夜，反應(yīng)應(yīng)完后向向各體系系中加11L100looadiing buffferr,將其全全部點樣樣到0.7%的的瓊脂糖糖凝膠中中進(jìn)行電電泳檢測測。將酶酶切鑒定定符合要要求的菌菌株隨機(jī)機(jī)取一個個（命名名為KMMQZ33）送TTaKaaRa寶寶生物公公司測序序。1.6.44 表達(dá)載載體的擴(kuò)擴(kuò)增由于購買的的表達(dá)載載體是以以純質(zhì)粒粒的形式式提供

27、，需需要將其其轉(zhuǎn)入大大腸桿菌菌內(nèi)進(jìn)行行擴(kuò)增。故故先進(jìn)行行表達(dá)載載體的常常規(guī)轉(zhuǎn)化化，再從從大腸桿桿菌中提提取質(zhì)粒粒進(jìn)行后后續(xù)試驗驗操作。將購買的表表達(dá)載體體pHIIS15525（110gg）用適適量的水水（約220LL）溶解解后，取取1LL轉(zhuǎn)化大大腸桿菌菌DH55感受受態(tài)細(xì)胞胞（感受受態(tài)細(xì)胞胞的制備備與轉(zhuǎn)化化方法與E.ccolii JMM1099相同），在在含有1100g/mmL氨芐芐青霉素素的LBB培養(yǎng)基基上篩選選陽性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子，并并通過提提取質(zhì)粒粒和酶切切進(jìn)行鑒鑒定，將將陽性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子命命名為DDH5- ppHISS15225。1.6.55 重組表表達(dá)載體體的構(gòu)建建 內(nèi)切葡葡聚糖酶酶基因（已已經(jīng)

28、去掉掉信號肽肽編碼序序列）的的準(zhǔn)備挑取一環(huán)EE.cooli JM1109（含含目的基基因）在在含氨芐芐青霉素素的LBB平板上上劃線培培養(yǎng)過夜夜，然后后挑取單單菌落接接種100mL含含相應(yīng)抗抗生素的的LB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基，337劇劇烈振蕩蕩培養(yǎng)112-14hh后，按按質(zhì)粒提提取試劑劑盒說明明進(jìn)行質(zhì)質(zhì)粒的提提取，提提取完后后進(jìn)行瓊瓊脂糖凝凝膠電泳泳檢測提提取質(zhì)量量和大致致濃度。先先將質(zhì)粒粒進(jìn)行BBgl = 2 * ROMAN III單酶酶切，后后進(jìn)行Spph = 1 * ROMAN I單酶切，兩者酶切切體系與與方法一一致。酶酶切完后后向兩管管中加入入5.55L100looadiing bufffer

29、r，最后后將兩次次單酶切切的質(zhì)粒粒DNAA進(jìn)行瓊瓊脂糖凝凝膠電泳泳，然后后從凝膠膠中回收收所需要要的目的的條帶，其其方法與與PCRR產(chǎn)物的的瓊脂糖糖凝膠回回收相同同，并取取5LL電泳檢檢測其回回收的大大致濃度度。 表達(dá)載載體的準(zhǔn)準(zhǔn)備挑取一環(huán)大大腸桿菌菌DH55（含含表達(dá)載載體質(zhì)粒粒）在含含氨芐青青霉素的的LB平平板上劃劃線培養(yǎng)養(yǎng)過夜，然然后挑取取單菌落落接種110mLL含相應(yīng)應(yīng)抗生素素的LBB液體培培養(yǎng)基，337劇劇烈振蕩蕩培養(yǎng)112-14hh后，按按質(zhì)粒提提取試劑劑盒操作作進(jìn)行質(zhì)質(zhì)粒的提提取，提提取完后后進(jìn)行瓊瓊脂糖凝凝膠電泳泳檢測提提取質(zhì)量量和大致致濃度。將將提取的的質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行Bggl和S

30、phh雙酶切切。同樣，為為了保證證酶切后后回收的的DNAA濃度，需需做3管管該反應(yīng)應(yīng)體系。將將上述反反應(yīng)體系系置377恒溫溫培養(yǎng)箱箱酶切過過夜，酶酶切完后后向管中中加入55.5L100looadiing buffferr混合均均勻，取取5LL進(jìn)行電電泳檢測測酶切情情況，將將其余反反應(yīng)液進(jìn)進(jìn)行瓊脂脂糖凝膠膠電泳，然然后從凝凝膠中回回收所需需要的目目的條帶帶，其方方法與PPCR產(chǎn)產(chǎn)物的瓊瓊脂糖凝凝膠回收收相同，并并取5L電泳泳檢測其其回收的的大致濃濃度。 連接及及轉(zhuǎn)化將已經(jīng)準(zhǔn)備備好的內(nèi)內(nèi)切葡聚聚糖酶基基因與表表達(dá)載體體按表66加入進(jìn)進(jìn)行連接接反應(yīng)：表6 連接接體系Tablee 6 TThe lig

31、gatiion sysstemm表達(dá)載體/L目的基因/LT4 DNNA liggasee/L連接buffferr/L超純水/L總體系/L3523215將上述兩個個連接體體系置PPCR儀儀中166連接接過夜，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化時分分別取110LL連接液液分別轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌DDH5感受態(tài)態(tài)細(xì)胞并并涂布在在含有1100g/mmL氨芐芐青霉素素的LBB平板上上，待菌菌落長出出后，進(jìn)進(jìn)行菌落落PCRR、酶切切鑒定15,16。2 結(jié)果與與分析2.1 目目的基因因的獲得得以提取的BB3質(zhì)粒粒為模板板根據(jù)設(shè)設(shè)計合成成的引物物進(jìn)行PPCR，獲獲得的PPCR產(chǎn)產(chǎn)物為不不含目的的基因信信號肽序序列的片片斷，其其大小約約為1.

32、5Kbb，對獲獲得的PPCR產(chǎn)產(chǎn)物取33L進(jìn)進(jìn)行電泳泳，結(jié)果果見圖22。結(jié)果表明PPCR產(chǎn)產(chǎn)物大小小與目的的基因大大小（115000bp）接接近。然后對對產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行膠回回收，以以去掉PPCR體體系中的的引物、模模板DNNA、酶酶等雜質(zhì)質(zhì)，使其其純度滿滿足隨后后連接要要求，回回收后取取5LL進(jìn)行電電泳，結(jié)結(jié)果見圖圖2。圖2 PCCR擴(kuò)增增產(chǎn)物結(jié)結(jié)果及產(chǎn)產(chǎn)物膠回回收Fig2 Thhe rresuultss off PCCR aand gell reeclaaim2.2 目目的基因因的克隆隆將膠回收后后的目的的基因與與克隆載載體pMMD188-T Vecctorr進(jìn)行連連接后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化E.colli J

33、JM1009感受受態(tài)細(xì)胞胞，長出出菌落后后挑取大大小均一一的菌落落進(jìn)行菌菌落PCCR檢測測陽性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子，菌菌落PCCR結(jié)果果如圖3所示示。 圖3 E.colli JJM1009轉(zhuǎn)化化子的菌菌落PCCR檢測測Fig3 Ideentiificcatiion of reccombbinaant E.ccolii JMM1099 byy coolonny PPCR從電泳結(jié)果果可以看看出，在在挑取的的9個轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子中中，有88個轉(zhuǎn)化化子通過過其菌落落PCRR后得到到與目的的基因的的大小相相一致的的產(chǎn)物，只只有9號號轉(zhuǎn)化子子未得到到PCRR產(chǎn)物，說說明它是是一個假假陽性。根根據(jù)以上上菌落PPCR結(jié)結(jié)果，在在

34、288號轉(zhuǎn)化化子中隨隨機(jī)挑取取一個單單菌落（命命為KMMQZ33）接種種10mmL LLB液體體培養(yǎng)基基（含1100g/mmL氨芐芐青霉素素）377劇烈烈振蕩培培養(yǎng)122-16hh后按質(zhì)質(zhì)粒提取取試劑盒盒操作提提取質(zhì)粒粒，分別別取3L和55L進(jìn)進(jìn)行單雙雙酶切鑒鑒定，結(jié)結(jié)果如圖4。 圖4 E.colli JJM1009轉(zhuǎn)化化子的酶酶切檢測測Fig4 Iddenttifiicattionn off E.colli JJM1009 rrecoombiinannt bby rresttricctioon aanallysiis電泳結(jié)果表表明：通通過雙酶酶切后可可以得到到與目的的基因大大小一致致的條帶帶

35、，但轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子質(zhì)質(zhì)粒Spph單單酶切后后發(fā)現(xiàn)了了兩條條條帶，和和該質(zhì)粒粒的雙酶酶切結(jié)果果一致，經(jīng)經(jīng)過分析析發(fā)現(xiàn)其其原因是是：PCCR產(chǎn)物物與克隆隆載體ppMD118-TT Veectoor在連連接時沒沒有按目目的基因因的正向向順序進(jìn)進(jìn)行連接接，剛好好相反，目目的基因因反向連連接在了了克隆載載體上，但但這不影影響本試試驗的后后續(xù)試驗驗，酶切切結(jié)果表表明目的的基因已已經(jīng)連接接到了克克隆載體體pMDD18-T VVecttor上上。2.3 表表達(dá)載體體的擴(kuò)增增購買的表達(dá)達(dá)載體是是以凍干干的質(zhì)粒粒形式提提供，按按操作手手冊說明明需要將將其轉(zhuǎn)入入大腸桿桿菌內(nèi)進(jìn)進(jìn)行常規(guī)規(guī)的擴(kuò)增增后再提提取質(zhì)粒粒進(jìn)行重重組操

36、作作，故先先進(jìn)行表表達(dá)載體體的常規(guī)規(guī)轉(zhuǎn)化。將購買的表表達(dá)載體體質(zhì)粒ppHISS15225（約約10g）用用適量的的水（約約20L）溶溶解后，取取1LL轉(zhuǎn)化大大腸桿菌菌DH55感受受態(tài)細(xì)胞胞（感受受態(tài)細(xì)胞胞的制備備與轉(zhuǎn)化化與E.colli JJM1009相同同），涂涂布在含含有1000gg/mLL氨芐青青霉素的的LB培培養(yǎng)基上上，待長長出轉(zhuǎn)化化子后（約約24hh），挑挑取大小小均一的的單菌落落接種110mLL LBB液體培培養(yǎng)基，37劇烈振蕩培養(yǎng)12-16h后按質(zhì)粒提取試劑盒操作提取質(zhì)粒，再分別取3L和5L進(jìn)行未酶切和單酶切的鑒定，電泳結(jié)果見圖5。圖5 表達(dá)達(dá)質(zhì)粒ppHISS15225的酶酶切檢

37、測測Fig5 Reestrricttionn annalyysiss off thhe pplassmidd pHHIS115255電泳結(jié)果表表明，未未經(jīng)酶切切的pHHIS115255質(zhì)粒其其分子量量比實際際分子量量（約77.4KKb）大大，但單單酶切后后分子量量符合實實際大小小，其可可能原因因是質(zhì)粒粒在復(fù)制制過程中中形成了了質(zhì)粒多多聚體，單單酶切后后未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)非特異異性切割割，說明明該質(zhì)粒粒是pHHIS115255質(zhì)粒。同同時將該該轉(zhuǎn)化子子命為DDH5-pHHIS115255。2.4 重重組表達(dá)達(dá)載體的的構(gòu)建2.4.11 內(nèi)切切葡聚糖糖酶基因因（已經(jīng)經(jīng)去掉信信號肽編編碼序列列）的準(zhǔn)準(zhǔn)備通過轉(zhuǎn)化

38、子子的菌落落PCRR和酶切切檢測后后，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)目的基基因（已已經(jīng)去掉掉信號肽肽編碼序序列）反反向連接接在pMMD188-T Vecctorr克隆載載體上，為為保證隨隨后的酶酶切和表表達(dá)載體體的正確確連接，提提取轉(zhuǎn)化化子質(zhì)粒粒后先進(jìn)進(jìn)行Bggl單單酶切，回回收后再再進(jìn)行SSph單酶切切，這樣樣通過兩兩次單酶酶切后保保證了目目的基因因兩端分分別是由由Bgll、Spph酶酶切后產(chǎn)產(chǎn)生的粘粘性末端端，通過過兩次單單酶切后后用膠回回收試劑劑盒回收收目的條條帶，取取5LL電泳檢檢測其大大致濃度度，結(jié)果果見圖66。圖6 膠回回收的目目的基因因與表達(dá)達(dá)質(zhì)粒ppHISS15225 Fiig6 Reeclaaime

39、ed ttargget genne aand plaasmiid ppHISS15225 2.4.22 表達(dá)達(dá)載體的的準(zhǔn)備含表達(dá)載體體質(zhì)粒ppHISS15225的大大腸桿菌菌DH55在含含氨芐青青霉素的的LB平平板上劃劃線培養(yǎng)養(yǎng)過夜，然然后挑取取單菌落落接種110mLL 含相相應(yīng)抗生生素的LLB液體體培養(yǎng)基基，377劇烈烈振蕩培培養(yǎng)122-14hh后，按按質(zhì)粒提提取試劑劑盒操作作進(jìn)行質(zhì)質(zhì)粒pHHIS115255的提取取，并對對質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行Bggl、Spph雙雙酶切，電電泳后切切取目的的條帶進(jìn)進(jìn)行膠回回收，并并取5L電泳泳檢測其其大致濃濃度，結(jié)結(jié)果見圖圖6。2.4.33 轉(zhuǎn)化化子的篩篩選及檢檢測用

40、T4 DDNA連連接酶連連接膠回回收的目目的基因因（即去去掉信號號肽編碼碼序列的的內(nèi)且葡葡聚糖酶酶基因）與與表達(dá)質(zhì)質(zhì)粒pHHIS115255，將連連接體系系置PCCR儀中中16連接過過夜，取取10L連接接液轉(zhuǎn)化化大腸桿桿菌DHH5感感受態(tài)細(xì)細(xì)胞并涂涂布在含含有1000gg/mLL氨芐青青霉素的的LB平平板上，待待菌落長長出后，挑挑取菌落落大小均均一的單單菌落進(jìn)進(jìn)行菌落落PCRR，結(jié)果果見圖77。 菌菌落PCCR結(jié)果果表明，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子33、5、66、7均均能得到到與目的的基因大大小相一一致的條條帶。根根據(jù)電泳泳結(jié)果隨隨機(jī)挑取取其中的的一個單單菌落培培養(yǎng)后提提質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行酶切切檢測，結(jié)結(jié)果見圖圖8。

41、圖7 E.colli DDH5轉(zhuǎn)化子子菌落PPCR 圖88 轉(zhuǎn)化化子質(zhì)粒粒酶切結(jié)結(jié)果Fig7 Reecommbinnantt E.colli DDH5collonyy PCCR FFig88 Resstriictiion anaalyssis of reccombbinaant結(jié)果表明，質(zhì)質(zhì)粒經(jīng)過過單酶切切后沒有有出現(xiàn)非非特異性性條帶，雙雙酶切后后可得到到與目的的基因大大小相一一致的條條帶，說說明目的的基因包包含的該該質(zhì)粒中中。通過過對轉(zhuǎn)化化子進(jìn)行行菌落PPCR及及其質(zhì)粒粒酶切檢檢測，表表明重組組質(zhì)粒已已經(jīng)轉(zhuǎn)進(jìn)進(jìn)了大腸腸桿菌DDH5中。將將該菌命命為pHHEC-Endd。3 討論3.1 芽芽孢

42、桿菌菌作為表表達(dá)體系系的優(yōu)點點芽孢桿菌為為革蘭氏氏陽性細(xì)細(xì)菌，細(xì)細(xì)胞壁不不含內(nèi)毒毒素，能能分泌大大量的蛋蛋白到體體外，能能形成芽芽孢，是是一些重重要工業(yè)業(yè)酶制劑劑的生產(chǎn)產(chǎn)菌。自自19558年SSpizzizeen117發(fā)現(xiàn)枯枯草桿菌菌1688菌株能能攝取外外源基因因以后，隨隨著DNNA重組組技術(shù)的的發(fā)明，特特別是金金黃色葡葡萄球菌菌(Sttaphhyloococccuss auureuus)帶帶抗性標(biāo)標(biāo)志的質(zhì)質(zhì)粒可作作為其載載體的發(fā)發(fā)現(xiàn)，芽芽孢桿菌菌基因工工程的工工作迅速速發(fā)展。作作為很有有吸引力力的外源源基因表表達(dá)的宿宿主，芽芽孢桿菌菌有以下下一些優(yōu)優(yōu)點:除炭疽桿菌菌(Baacillluss

43、 annthrraciis)和和蠟樣芽芽孢桿菌菌(Baacillluss ceereuus)等等外，多多數(shù)芽孢孢桿菌對對人畜無無害，不不像大腸腸桿菌那那樣具有有熱源性性脂多糖糖。遺傳學(xué)現(xiàn)在在相當(dāng)先先進(jìn)，很很多噬菌菌體和質(zhì)質(zhì)粒適合合于用作作克隆載載體。具有蛋白分分泌能力力強(qiáng)的特特性。當(dāng)當(dāng)分泌蛋蛋白跨過過細(xì)胞膜膜后，就就被加工工和直接接釋放到到培養(yǎng)基基中，這這使得回回收和純純化目的的蛋白較較為簡單單。良好的發(fā)酵酵基礎(chǔ)和和生產(chǎn)技技術(shù)。芽芽孢桿菌菌在工業(yè)業(yè)上長期期被用于于生產(chǎn)蛋蛋白酶、aa-淀粉粉酶以及及蘇云金金桿菌的的殺蟲晶晶體蛋白白等。在在相對簡簡單的培培養(yǎng)基中中能生長長到很高高的密度度。細(xì)胞胞的

44、生長長特性和和生理學(xué)學(xué)性質(zhì)都都被廣泛泛、深入入研究。經(jīng)過幾十年年的努力力，芽孢孢桿菌表表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)的優(yōu)越越性得到到發(fā)揮，許許多原核核和真核核基因被被克隆和和表達(dá)，其其中有的的己應(yīng)用用于工業(yè)業(yè)生產(chǎn)，取取得了不不少成績績。但是是，用芽芽孢桿菌菌作為產(chǎn)產(chǎn)品生產(chǎn)產(chǎn)菌也暴暴露出一一些問題題:蛋白白酶對目目的蛋白白的降解解，質(zhì)粒粒的不穩(wěn)穩(wěn)定，真真核蛋白白分泌表表達(dá)量低低或不能能分泌表表達(dá)等。3.2 信信號肽對對外源基基因表達(dá)達(dá)的影響響信號肽對外外源基因因分泌表表達(dá)至關(guān)關(guān)重要，同同一種蛋蛋白酶在在不同信信號肽的的作用下下，即使使都能分分泌表達(dá)達(dá)，其分分泌效率率也會相相差甚遠(yuǎn)遠(yuǎn)。Yaang Yanng118等等

45、人研究究表明：當(dāng)使用用巨大芽芽孢桿菌菌的胞外外脂酶的的信號肽肽代替自自身的信信號肽時時，可提提高青霉霉素酰胺胺酶G表表達(dá)量11.7倍倍；Naagarrajaan19選擇了了枯草桿桿菌蛋白白酶、中中性蛋白白酶、芽芽孢桿菌菌RNAA酶和果果聚糖蔗蔗糖酶等等四種酶酶的信號號肽，以以芽孢桿桿菌BEE15110為宿宿主菌，分分別研究究它們對對重組鏈鏈霉抗生生素蛋白白分泌效效果的影影響。結(jié)結(jié)果表明明，攜帶帶四種融融合基因因的菌株株都能有有效分泌泌四聚體體鏈霉抗抗生素蛋蛋白，但但以用中中性蛋白白酶信號號肽時效效率最高高。大腸腸桿菌由由于細(xì)胞胞壁結(jié)構(gòu)構(gòu)與芽孢孢桿菌不不同，很很少能將將外源蛋蛋白分泌泌在胞外外，

46、大多多在胞內(nèi)內(nèi)形成包包含體的的形式。在在大腸桿桿菌中似似乎信號號肽的存存在對外外源基因因的表達(dá)達(dá)存在不不利，如如李相前前等20通過PPCR方方法分別別克隆CCel 12BB完整基基因和不不帶信號號肽基因因至pEET一220b載載體，構(gòu)構(gòu)建重組組質(zhì)粒ppET-20bbCeel122B和ppET一一20bbCell12BB-WSS，轉(zhuǎn)化化至大腸腸桿菌JJM1009DEE3誘導(dǎo)導(dǎo)表達(dá)后后，分析析酶活，結(jié)結(jié)果表明明去除信信號肽重重組菌單單位酶活活是未去去除信號號肽重組組菌的111倍多多。3.3 引引物的設(shè)設(shè)計Ryguss T21、Yaang Yanng22均報道道表明，外外源基因因在表達(dá)達(dá)載體的信號號

47、肽引導(dǎo)導(dǎo)比基因因自身信信號肽引引導(dǎo)下具有較較高的表表達(dá)水平平。Yaang發(fā)發(fā)現(xiàn)來自自Theermoobiffidaa fuuscaa的水解解酶只有有其密碼碼子適合合巨大芽芽孢桿菌菌時才能能成功的的表達(dá)，黃黃玉杰等等23人在巨巨大芽孢孢桿菌中中克隆到到了編碼碼內(nèi)切酶酶的基因因，該基基因片段段同己發(fā)發(fā)表的枯枯草芽孢孢桿菌gglyBBapprE之之間的同同源性為為35；同芽芽孢桿菌菌BP223 ccelBB、短小小芽孢桿桿菌內(nèi)切切葡聚糖糖酶和多多粘芽孢孢桿菌- 11，4-內(nèi)切葡葡聚糖酶酶的編碼碼基因的的同源性性只有227。表表明巨大大芽孢桿桿菌在密密碼偏愛愛性上與與其他芽芽孢桿菌菌存在著著差別。因因

48、此，在在設(shè)計引引物時，通通過分析析巨大芽芽孢桿菌菌和編碼碼該基因因的密碼碼子使用用頻率，引引入堿基基A。使使編碼的的內(nèi)切葡葡聚糖酶酶能夠正正確的與與表達(dá)載載體pHHIS115255上的信信號肽融融合而不不至改變變閱讀框框。在本本實驗中中，我們們通過PPCR去去除枯草草芽孢桿桿菌C-36內(nèi)內(nèi)切葡聚聚糖酶基基因中編碼信信號肽的的序列。4 結(jié)論 本本實驗成成功去除除枯草芽芽孢桿菌菌C-336內(nèi)切切葡聚糖糖酶基因因中編碼碼信號肽肽的序列列，并且且將去除除信號肽肽的枯草草芽孢桿桿菌C-36內(nèi)內(nèi)切葡聚聚糖酶基基因與巨巨大芽孢孢桿菌表表達(dá)載體體pHIIS15525進(jìn)進(jìn)行連接接，成功功構(gòu)建了重組表表達(dá)載體體。

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