雛鴨病毒性肝炎的診治技術(shù)

1、雛鴨病毒性肝炎的診治技術(shù)鴨病毒性肝炎(Duckvirushepatitis,DVH)簡稱鴨肝炎,是主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、高度致死性的傳染病。1950年,LevinePP和FabricantJ在美國首先報道了型鴨病毒性肝炎的發(fā)生。1954年,Asplin報道鴨病毒性肝炎在英國暴發(fā)流行。隨后,加拿大、西德、意大利、印度、法國、匈牙利、日本等國均有報道。1963年首次報道在我國的上海地區(qū)某些鴨場也發(fā)生鴨病毒性肝炎DHV-型。而DHV-型和DHV-型病毒分別于1965年發(fā)現(xiàn)于英國諾?？撕?969年發(fā)現(xiàn)于美國長島,DHV-型至今尚無其他國家的報道。但近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼報道了DHV-

2、型的變異情況,Barnhardt株是在美國一個農(nóng)場分離到的一個明顯的血清學(xué)變異株,與DHV-型在中和試驗中呈部分交叉反應(yīng)。在福州地區(qū)發(fā)現(xiàn)不能被標準DHV-型疫苗保護的鴨肝炎。蘇敬良等從疑似鴨肝炎的病死鴨體內(nèi)分離到1株與型、型鴨肝炎病毒無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的小RNA病毒,暫時將其病毒稱為新型鴨肝炎病毒。在該病的診斷上,依據(jù)其發(fā)病日齡、臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，但確診和病毒定型必須依賴進一步的病原學(xué)和血清學(xué)診斷。目前，應(yīng)用于DHV的血清學(xué)診斷主要有中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、瓊脂免疫擴散試驗、間接血凝試驗和免疫熒光等,下面就近年來的診斷方法做簡要概述。1臨床診斷該病主要發(fā)生于3周齡以下的雛

3、鴨,潛伏期短,常突然發(fā)病,感染雛鴨首先表現(xiàn)為跟不上群,此后短時間內(nèi)就停止運動,蹲伏并半閉眼。病鴨身體側(cè)臥、兩腿痙攣后踢,頭向后背,呈角弓反張樣。雛鴨在出現(xiàn)癥狀后1h左右就發(fā)生死亡。剖檢特征性病變主要在肝臟,常表現(xiàn)為肝臟腫大、質(zhì)脆,外觀淡紅、土黃或斑駁狀,表面有彌漫性出血點或出血斑；膽囊腫脹呈長卵圓形充滿膽汁,膽汁常呈褐色或淡茶色；脾臟和腎臟也多有不同程度的腫脹,表面有出血點或呈斑駁狀；心肌常呈淡灰色,質(zhì)軟有淤血,似開水煮樣；此外,部分病例還可見喉、氣管、支氣管等有輕度卡他性炎癥及腦充血、出血等現(xiàn)象5。根據(jù)該病的發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化可作出初步診斷。2實驗室診斷2.1病毒的分離和初步鑒定病

4、毒初代分離一般使用鴨胚,在鴨胚中連續(xù)傳幾代后,很容易在鴨胚中增殖,Levine和Fabricant（1950）首次用鴨胚分離DHV獲得成功。因目前國內(nèi)尚無SPF鴨場,而鴨胚中又往往含有DHV母源抗體,妨礙病毒增殖,故試驗研究以及制作疫苗時接種和傳代常用SPF雞胚,病毒感染后主要表現(xiàn)為胚胎蜷縮,發(fā)育不良,全身水腫,體表充血且頭頸、背部等常有散在的針尖大小的出血點。肝臟為土黃、灰綠或鮮紅色,腫大、質(zhì)脆,出血點明顯,邊緣壞死或在表面有灰綠色或黃白色壞死區(qū),呈花斑狀,此外,有的雞胚尿囊液和卵黃囊還常呈綠色。胚體變化有一定的診斷意義。獲得高純度的病毒抗原可以對病毒進行電鏡直接觀察,并開展免疫學(xué)監(jiān)測、診斷

5、以及分子生物學(xué)研究。Taylor(1967)試圖以硫酸銨沉淀、超速離心方法對細胞增殖的DHV進行純化,但未能最終達到目的。以后很多學(xué)者嘗試著先離心初提,然后經(jīng)氯仿抽提,PEG反透析濃縮蔗糖密度梯度離心等方法進行提純,以得到較為純凈的病毒,也未能如愿。楊奎以抗DHVIgG偶聯(lián)活化的Sepharose4B制成親和層析柱,提純感染致死的雛鴨肝臟勻漿中的病毒,電鏡下背景干凈,雜蛋白少,病毒大小約為40nm,但病毒的特性未進一步驗證。孫剛等在電鏡下可見到直徑為32nm49nm的病毒粒子,顆粒結(jié)構(gòu)清晰,大小和結(jié)構(gòu)均符合型的特征。DHV由于病毒顆粒較小,得到較為純化的病毒一直困擾著研究者,很多學(xué)者通過各種提

6、純的方法進行嘗試,但至今尚未見到一張確切的純化病毒的電鏡照片。2.2中和試驗由于至今尚未明確DHV的基因序列,因此該病的實驗室診斷主要依靠血清學(xué)中和試驗加以診斷。LevinePR等（1950）首先將中和試驗(Virus-neutralizationtest,VN)應(yīng)用于DHV診斷鑒定,以后逐漸為各國學(xué)者所引用。通常在雞胚上以固定血清-稀釋病毒法進行,也有人在鴨胚、雛鴨或病毒適應(yīng)細胞中進行試驗。Hwang記述了一種準確、可重復(fù)的型鴨肝炎病毒雞胚中和試驗。WoolcockPR等9首先報道了用中和抗體進行的空斑減少試驗,認為要比雞胚中和試驗敏感得多。Chalmers和Woolcock檢測了從16個非

7、感染鴨收集的血清,其半數(shù)空斑減少滴度(VN)在112到1250之間,平均159。他們建議陰性對照血清的最大空斑減少滴度應(yīng)設(shè)為1250。KaletaEF10用北京鴨腎細胞培養(yǎng)的DHV進行了微量中和試驗,既快速又易于判定終點。陳琨等成功地在鴨胚單層肝細胞上進行了DHV-型的微量血清中和試驗,發(fā)現(xiàn)DHV形成CPE的能力可以被特異性血清中和,可以用于病毒鑒定、疫病診斷和免疫檢測。到目前為止,VN仍是診斷鴨病毒性肝炎的最可靠的方法,該方法被認為是既特異又敏感,是公認的方法。缺點為煩瑣、費時，不能快速診斷,不適于基層應(yīng)用。2.3瓊脂免疫擴散試驗Murty等(1961)首次報道采用瓊脂擴散試驗診斷DHV。通

8、過不同距離、不同濃度的抗原與高免血清沿瓊脂帶發(fā)生的瓊擴反應(yīng),可用來檢測病毒抗原的滴度。許偉琦等試驗表明在瓊脂中加入2%PEG能加快反映速度。張濟培等用瓊擴試驗檢測提純后的DHV,發(fā)現(xiàn)瓊脂凝膠配制的最佳方案是pH7.2,NaCl為80g/L和瓊脂糖濃渡為10g/L。瓊脂擴散試驗雖然簡便易行,但準確性存在欠缺,并且有干擾,因此存在著一定的局限性。2.4間接血凝試驗司興奎等報道在純化DHV獲得較為滿意結(jié)果的基礎(chǔ)上,進一步應(yīng)用純化抗原進行間接血凝試驗（IHA）。孫泉云等將初提DHV經(jīng)SephadexG200柱層析純化后作為致敏抗原,戊二醛法固定綿羊紅細胞,BDB法致敏抗原紅血球建立了檢測DHV抗體的I

9、HA方法。IHA試驗敏感性高,所以致敏用抗原的純度要求高,而且必須保持良好的免疫活性。還有報道說21日齡前不易檢測到IHA抗體。所以對DHV早期診斷不適用。在敏感性和穩(wěn)定性方面有波動,限制了該方法的推廣應(yīng)用。2.5直接熒光抗體檢測Maiborda(1972)報道了快速和準確的診斷方法是接種雛鴨采用直接熒光抗體檢測（FA）。用FA確定了北京地區(qū)流行的DHV為I型。胡清海等用鴨胚細胞做成滴片進行FA檢測DHV。劉建采用感染新型鴨肝炎強毒后死亡鴨的腎細胞做滴片進行熒光染色,可檢測到病毒抗原存在,為臨床上快速診斷新型鴨病毒性肝炎提供了一種檢測方法。該方法準確簡便,但對設(shè)備要求較高。2.6斑點免疫金滲濾

10、法張小飛等18用膠體金標記提純后的兔抗鴨肝炎病毒(DHV)IgG,建立了一種以微孔濾膜為固相載體,以紅色膠體金為標記物的檢測DHV的斑點免疫金滲濾法（DIGFA）,并確定了最佳試驗條件。該法既可定性,亦可定量,對純化DHV的最小檢測量為4.12ng/點,其敏感性為抗原斑點試驗(AST)的2倍。DIGFA法具有敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點。但其要求較高的抗原純度,這一點難以達到。2.7酶聯(lián)免疫吸附試驗應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）進行抗原、抗體的檢測,比較敏感、快速,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷。趙新柳等首次建立了間接EL

11、ISA法以檢測DHV抗體,結(jié)果表明，ELISA陽性檢出率為100%。陳溥言等20報道了DHV單克隆抗體的成功制備,并建立了檢測DHV的夾心ELISA方法,隨后范偉興等21用單克隆抗體建立了Dot-ELISA檢測方法。楊奎等用辣根過氧化物酶標記法成功地檢測了DHV抗體。該法與以polyomyl板或polystyrene為固相載體的ELISA法相比,抗原用量少,很適于DHV這類難以提純的病毒的抗體檢測。孫泉云等將單抗的高度特異性與ELISA的高度靈敏性結(jié)合起來,建立了用以檢測DHV抗體的單抗捕捉法ELISA方法,該法能有效區(qū)分陰、陽性血清,非特異性背景很小。同時對抗原的純度要求也很低,甚至是尿囊液

12、也能克服非特異性反應(yīng)。楊萍萍等制備了DHV單克隆抗體,并用于檢測DHV。馬秀麗等23用辣根過氧化物酶標記純化的型DHV單克隆抗體建立了檢測DHV的Dot-ELISA法。很多學(xué)者建立了用以診斷DHV的ELISA方法,其優(yōu)點是靈敏度高,操作簡便,特異性強。但因病毒的純化和DHV陰性血清的制備等均存在一定難度,該方法在DVH的檢測診斷方面還未能得到廣泛的應(yīng)用。2.8其他血清學(xué)診斷方法在DVH的診斷上除上述方法外,用來診斷鴨病毒性肝炎的方法還有被動血凝試驗，SPA協(xié)同凝集試驗，膠體金免疫電鏡技術(shù)，單克隆抗體-PAP法和核酸探針等方法,但因某些原因均還存在一定爭議,未能得到廣泛推廣和應(yīng)用。3小結(jié)盡管多年來國內(nèi)外很多學(xué)者對DHV進行了大量研究,但到目前為止,尚未能摸索出一種便捷的提純程序,因而至今尚未得到純化的病毒,這就使病毒的深入研究大受限制,對其分子生物學(xué)特性的研究也難以著手。因此,繼續(xù)進行病毒提純方法的改進,將顯得尤為重要。對于DHV診斷方法的研究,已經(jīng)取得了一定的成績,建立了許多基于血清學(xué)的診斷方法,基本能夠快速簡便地做出實