DNA甲基化和臨床應用培訓課件

1、目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)為什么熊貓是黑白的？ 基因決定命運為什么熊貓是黑白的？ 基因決定命運 同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。 同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但先從表觀遺傳學談起相同的基因型 不同的表型 ? 基因環(huán)境表型表觀遺傳學先從表觀遺傳學談起相同的基因型 不同的表型 ? 基因環(huán)境現(xiàn)代表觀遺傳學概念： 基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。表觀遺傳學的現(xiàn)象（基因表達的調(diào)控方式）

2、：DNA甲基化-表觀遺傳學的核心（最初始的調(diào)控方式）組蛋白修飾MicroRNAGenomic imprinting現(xiàn)代表觀遺傳學概念：不同層次表達調(diào)控不同層次表達調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位以共價鍵結(jié)合一個甲基基團。DNA甲基化的概念DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT DNA甲基化是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶： DNMT1、 DNMT3A和D

3、NMT3B。DNMT1- 持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；與甲基化相關(guān)，缺乏引起基因組低甲基化，染色體缺失、重排、突變畸形。DNMT3A、DNMT3B- 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶；與去甲基化相關(guān)，在胚胎干細胞和早期胚胎中高度表達，缺乏引起胚胎死亡，在腫瘤組織中廣泛高表達。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)通常啟動子和第一個外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。結(jié)構(gòu)基因組中70% 90% 的獨立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島約有60以上基因的啟動子含有CpG島。 是結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點。CpG島（C

4、pG island）預測軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/通常啟動子和第一個外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)DNA甲基化的生物學作用在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達轉(zhuǎn)錄抑制特征性表型基因的表達（膚色、毛發(fā)） X染色體的失活（X-inactivation ）基因印記堿基突變腫瘤代謝DNA甲基化的生物學作用在

5、發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達 DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細胞增殖過程中通過依賴于DNA復制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳遞給子細胞。但在胚胎發(fā)育的不同時期，基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會發(fā)生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段，甲基化模式在配子形成時已經(jīng)建立。DNA甲基化與胚胎發(fā)育 DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，DNA甲基化在動物胚胎和生殖細胞發(fā)育過程中的重編程DNA甲基化在動物胚胎和生殖細胞發(fā)育過程中的重編程CPG island的功能：通過甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達 基因表達的調(diào)控開關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制CPG island的功能：通

6、過甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基影響基因表達 直接抑制基因表達或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族 識別，而后者可通過吸引補充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ，以間接方式影響基因表達。影響基因表達 直接抑制基因表達或甲基化的 Cp IAP: intracisternal A particle去甲基化：灰鼠基因（agouti）僅微量表達甲基化：基因超量表達特征性表型基因的表達 IAP: intracisternal A partX染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation ）：生長發(fā)育過程中，雌性哺乳類動物細胞中的兩條X染色體其

7、中一條失去活性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化，導致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍 基因產(chǎn)物，保持和雄性動物X染色體 數(shù)量及功能上的一致性。X染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation 基因組印記？組織或細胞中，基因的表達具有親本選擇性，即只有一個親本的等位基因表達，而另一親本的等位基因不表達或很少表達的現(xiàn)象，相應的基因則稱為印記基因。父系不表達稱父系印記母系不表達稱母系印記基因印記基因組印記？組織或細胞中，基因的表達具有親本選擇性，即只有一差異甲基化區(qū)域 差異甲基化區(qū)域(differentially methylated r

8、egion，DMR)，是指染色體上甲基化狀態(tài)具有親本特異性的區(qū)域，即來源于不同親本的DNA序列甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域 差異甲基化主要發(fā)生在基因的啟動子區(qū)，少數(shù)在外顯子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的印記基因大多數(shù)具有DMR或受DMR調(diào)控。差異甲基化區(qū)域 差異甲基化區(qū)域(differentially堿基C T突變堿基突變 甲基化 突變堿基C T突變堿基突變 腫瘤細胞發(fā)生時常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶表達水平的提高、基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導致基因組不穩(wěn)定，如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表達以及抑癌基因被抑制表達等。DNA甲基化與腫瘤 腫瘤細胞

9、發(fā)生時常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)A基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析高效液相色譜高效毛細管電泳法B候選基因(Candidate Gene)甲基化分析 甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法重亞硫酸鹽測序法甲基化特異性的PCR甲基化熒光法(MethyLight)焦磷酸測序 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法甲基化檢測相關(guān)技術(shù)A基因組甲基化水平(Methylation ContentC. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分

10、析 限制性標記基因組掃描 甲基化間區(qū)位點擴增 甲基化CpG島擴增 差異甲基化雜交 由連接子介導PCR出的HpaII小片斷富集分析 甲基化DNA免疫沉淀法 C. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析 高效液相色譜法高效液相色譜法直接測序法直接測序法焦磷酸測序法 通過檢測CpG對應位點上C/T滲入的比例對目標位點的甲基化程度進行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。焦磷酸測序法 通過檢測CpG對應位點上C全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測序（WGBS）全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測序（WGBS）芯片平臺 Illumina 850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲

11、基化狀態(tài)。850K芯片不但保持了對CpG島，基因啟動子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強了增強子區(qū)以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應用于干細胞研究、腫瘤和其他復雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。 Illumina 850K芯片技術(shù)流程芯片平臺 Illumina 850K芯片可檢測DNA甲基化和臨床應用培訓課件目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細胞分化發(fā)育，基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因

12、選擇性的去甲基化的過程。最后，這種DNA甲基化模式就相對穩(wěn)定下來。正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細胞腫瘤組織的DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。腫瘤細胞的特征：癌基因 低甲基化 被激活抑癌基因 高甲基化 被沉默腫瘤組織的DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，DNA甲基化和臨床應用培訓課件應用前景1-腫瘤的早期診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進行的，導致惡性腫瘤表型的表達優(yōu)點：DNA甲基化檢測具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點。（血液、粘膜上皮標本）缺點：特異性不足應用

13、前景1-腫瘤的早期診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早表觀遺傳學生物標記開發(fā) 2017年3月，張鹍教授團隊在Nature Genetics（NG）雜志發(fā)布了令人振奮的研究成果，利用更靈敏的算法配合組織甲基化模式開發(fā)的無創(chuàng)診斷技術(shù)，可以檢測并定位腫瘤。通過比較腫瘤和正常細胞的DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異的甲基化Marker。表觀遺傳學生物標記開發(fā) 2017年3月，張鹍 燃石醫(yī)學自主研發(fā)了無創(chuàng)甲基化檢測系統(tǒng)(MERMAID)，運用多層級甲基化探針設計策略，可實現(xiàn)在檢測成本可控的情況下同時檢測超過10萬個臨床診斷相關(guān)的甲基化CpG位點，并通過機器學習算法建立分類模型，實現(xiàn)對檢測樣本自動分型。 cfD

14、NA無創(chuàng)甲基化檢測系統(tǒng)(MERMAID) 用于肺部占位病變（含肺癌）的早篩可實現(xiàn)99.6%的敏感性和100%的特異性，用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實84.8%的敏感性和87.5%的特異性。cfDNA甲基化液體活檢技術(shù) 燃石醫(yī)學自主研發(fā)了無創(chuàng)甲基化檢測系統(tǒng)(ME應用前景2-腫瘤復發(fā)的獨立預測因子口腔鱗狀細胞癌時存在RECK基因甲基化的患者復發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時，患者存活時間明顯縮短LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in o

15、ral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.應用前景2-腫瘤復發(fā)的獨立預測因子口腔鱗狀細胞癌時存在RE應用前景3-腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望應用前景3-腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DN優(yōu)點：新型抗腫瘤藥物缺點：無基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會引起整體的低甲基化; 藥物的活化作用可逆，療效依賴于藥物的持續(xù)存在;大劑量應用時會對正常細胞有毒副作用 是否會誘發(fā)第二腫瘤？應用前景3-腫瘤的去甲基化治療優(yōu)點：新型抗腫瘤藥物 是否會誘發(fā)第二腫瘤？應用前景3-腫