鏡瘧原蟲技術(shù)(1)課件

1、 鏡檢瘧原蟲技術(shù) 2012.31主要內(nèi)容血片制作與染色瘧原蟲形態(tài)與鑒別瘧原蟲鏡檢2血片制作與染色血片制作血片染色3血片制作（所需用具）載玻片75%的酒精棉球采血針記號(hào)筆 玻片盒 4血片制作（血膜的制作）用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種： 一種是將血液涂成薄膜狀，稱薄血膜；一種是將血液涂成圓盤形，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。5血片制作（取血方法） 采血部位以耳垂較為合適，也可在手指末端采血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指輕輕捻轉(zhuǎn)耳垂邊緣或夾住被檢者手指尖稍下方，右手持消毒針，迅速刺入取血部位1-2mm，不宜過深或過淺。然后用左手

2、大拇指、食指和右手中指協(xié)同擠出血滴。7血片制作（血膜的涂制） 取潔凈的玻片2張，1張作載片，1張作推片（具有光滑邊緣），右手拇指和食指夾持推片側(cè)緣中部，用推片左下角刮取血液4-5ul（約火柴頭大?。?，再用該端中部刮取血液1-1.5ul（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。?，將左下角的血滴涂于載片的中央偏右，由里向外劃圈涂成直徑0.8-1.0cm的圓形厚血膜（厚血膜的厚度以一個(gè)油鏡視野內(nèi)可見到5-10個(gè)白細(xì)胞為宜）。用干棉球抹凈角上的血漬，然后將推片下緣平抵載玻片的中線，當(dāng)血液在載玻片和推片之間向兩側(cè)擴(kuò)展至約2cm寬時(shí)，使兩玻片保持2535度夾角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜。推制時(shí)速度要均勻，血滴大小、

3、推片與載片之間夾角大小及展開血膜的速度快慢等常影響血膜的厚薄。制成的薄血膜應(yīng)在玻片上形成平鋪的血細(xì)胞，細(xì)胞之間互相接觸而不相互重疊。每張載玻片上分別做1個(gè)薄血膜和1個(gè)厚血膜。 8血片制作（標(biāo)準(zhǔn)血膜的位置） 10血片制作（血膜編號(hào)） 血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫上受檢者的號(hào)碼，以防差錯(cuò)，待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上受檢者的個(gè)人編號(hào)，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。11血片制作（涂制血膜的注意事項(xiàng) ）涂制血膜時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。推片的邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。剛涂制的血膜要平放，干前勿傾斜，以免造成厚血膜

4、厚薄不均，厚處不易溶血和著色而影響檢查結(jié)果。血膜讓其自然干燥，切忌用太陽(yáng)曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。12血片染色（常用染液的配制）吉氏染液的配制 吉氏粉 5.0g 甲醇 250ml 甘油 250ml14血片染色（吉氏染液的配制）將吉氏粉5g置于研缽中，加入少量甘油小心充分研磨，然后邊加邊磨，至250ml甘油加完研磨均勻?yàn)橹梗谷?00ml有塞容量瓶中。每次加入少量甲醇至研缽中，多次洗滌研缽中的殘留液，洗凈為止。洗液均倒入容量瓶中，再加入部分甲醇，塞緊瓶塞，搖勻，再加甲醇稀釋至500ml的刻度為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，置于5560水浴中或溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)35天，多加搖動(dòng)，即成原液

5、。15血片染色（吉氏染液染色方法）先用甲醇固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色。單張血片染色：用中性蒸餾水或PH值7.0-7.2 緩沖液1毫升，加入吉氏染液1滴，混合均勻后，滴在厚薄血膜上，染色20-30分鐘，然后用清水輕輕將玻片上的染液漂洗干凈，晾干鏡檢。成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入新配的2%吉氏染液稀釋液（即2毫升吉氏染液加中性蒸餾水或PH值7.0-7.2 緩沖液98毫升稀釋均勻而成），浸沒厚薄血膜，染色30分鐘后，向染色缸中注入緩沖液或自來水，直至溢出，除掉染液表面上的浮渣，將液色缸中殘余的染液傾出，然后用水輕輕漂洗一次，干凈后取出玻片，將血膜朝下，插于晾干板上，待干鏡檢。1

6、7血片染色（影響血片染色好壞的因素）染料溶劑的質(zhì)量 染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時(shí)所用的器具必須干凈而無水份。染液的新舊 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常有沉渣。染液存放時(shí)間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制1-2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。 染液稀釋后使用時(shí)間 染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時(shí)使用，一般在半小時(shí)內(nèi)染色力最強(qiáng)。18血片染色（影響血片染色好壞因素）染液

7、的稀釋濃度與染色時(shí)間 染液的濃度高其著色就快而深，染色時(shí)間相對(duì)縮短，瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)粗大顯著，但顏色常偏藍(lán)；染液濃度過低則染色時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)一些，顏色偏酸紅，薛氏點(diǎn)不明顯或消失。 稀釋和沖洗用水 為使厚、薄血膜著色較好，應(yīng)使稀釋的染液呈中性或稍偏堿性，故應(yīng)用pH7.0pH7.2的水稀釋。當(dāng)染色太藍(lán)，可用pH較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用pH較高的緩沖液沖洗；如染色太深，可延長(zhǎng)沖洗時(shí)間，予以校正。19血片制作與染色的注意事項(xiàng)載玻片使用前一定要清潔，否則會(huì)影響血片制作和鏡檢結(jié)果。厚血膜干燥時(shí)不要加熱，否則會(huì)使瘧原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果。配制母液時(shí)過濾可除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量。固定薄

8、血膜時(shí)，不要將甲醇接觸到厚血膜，否則染色時(shí)厚血膜將不能溶血。沖洗染液時(shí)，水流要輕緩，不要沖掉厚血膜。20血片制作和染色（質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)） 好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血 膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。21血片制作和染色(質(zhì)量規(guī)范)22薄血膜中常見的血液成分中性白細(xì)胞酸性球血小板大單核球淋巴球紅血球24薄血膜中常見的血液成分25核 即細(xì)胞核或染色質(zhì)粒。在正常情況下核呈鮮紅色，呈圓形或不規(guī)則的顆粒狀。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個(gè)別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。有時(shí)因胞漿厚密或染色深藍(lán)，使核呈暗紅或紫紅色。瘧色素 不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而

9、異。間日瘧原蟲的色素顆粒呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲的色素顆粒呈細(xì)砂狀，黑褐色；人體瘧原蟲的基本結(jié)構(gòu)27薄血膜中瘧原蟲形態(tài)與鑒別被寄生的紅細(xì)胞核胞漿空泡瘧色素薛氏小點(diǎn)核28紅細(xì)胞 被間日瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞脹大、顏色變淡。瘧原蟲發(fā)育至阿米巴樣體，紅細(xì)胞出現(xiàn)薛氏點(diǎn)(Schuffners dots)。 被惡性瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞大小正常或稍微縮小，紅細(xì)胞上有時(shí)見到茂氏點(diǎn)(Maurers dots)。瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞29間日瘧早期滋養(yǎng)體-環(huán)狀體 約占寄生紅細(xì)胞的1/3，很少見到一個(gè)紅細(xì)胞寄生2個(gè)環(huán)狀體和一個(gè)環(huán)狀體有2個(gè)核。 30 間日瘧滋養(yǎng)體-大滋養(yǎng)體31間日瘧裂殖體2.1 未成熟裂殖體 （immat

10、ure schizont）經(jīng)40小時(shí)晚期滋養(yǎng)體發(fā)育成熟，蟲體變圓，空泡消失核開始分裂又稱裂殖體前期色素聚集成團(tuán)塊成熟裂殖體約有1224個(gè) 細(xì)胞核胞漿也隨之分裂受染RBC 脹大、顏色蒼白、蟲體幾乎充滿紅細(xì)胞32 間日瘧原蟲雌雄配子體3334惡性瘧原蟲-環(huán)狀體環(huán)纖細(xì)可見數(shù)粒，大小不一，紅色粗大的茂氏點(diǎn)核1個(gè)，但2個(gè)常見，紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲蟲體常位于紅細(xì)胞的邊緣 ，呈“鳥飛狀”35惡性瘧原蟲大滋養(yǎng)體 一般不出現(xiàn)在外周血蟲體小結(jié)實(shí)，圓形，不活動(dòng)瘧色素集中一團(tuán)，黑褐色原蟲此時(shí)開始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管36惡性瘧成熟裂殖體 裂殖子836個(gè)，通常1824個(gè)，排列不規(guī)則瘧色素集中成一團(tuán)蟲體占紅細(xì)胞體積的2/3

11、至3/4 37惡性瘧原蟲雌配子體新月形，兩端較尖核致密，深紅色，常位于中央瘧色素黑褐色，分布于核周圍38惡性瘧原蟲雄配子體臘腸形，兩端鈍圓胞質(zhì)色藍(lán)而略帶紅核疏松，淡紅色，位于中央瘧色素黑褐色，小桿狀，在核周圍較多 39薄血膜中瘧原蟲形態(tài)與鑒別各種瘧原蟲各期形態(tài)鑒別瘧色素顆粒鑒別大滋養(yǎng)體與大配子體的形態(tài)鑒別裂殖子與血小板的形態(tài)鑒別40各種瘧原蟲各期形態(tài)鑒別被寄生的紅細(xì)胞形態(tài)大小及染色深淺度（是否褪色）；胞漿色彩及其濃淡，結(jié)構(gòu)疏密，有否空泡及不著色帶，體積大??；色素斑點(diǎn)（薛氏點(diǎn)、茂氏點(diǎn)）；查其他各期形態(tài)是否存在作參考；色素顆粒的形態(tài)、顏色、排列。對(duì)于這一點(diǎn)應(yīng)掌握，尤其是厚血膜更為重要。否則在形態(tài)鑒

12、別上會(huì)混淆弄錯(cuò)。41瘧色素顆粒鑒別與原蟲在同一水平面；有立體感；色澤特殊，只有單色（色澤與背景色有關(guān)，須將視野放暗些）；形狀如米粒狀、沙粒狀、顆粒狀、短桿狀，細(xì)?？赡鄢啥?。42大滋養(yǎng)體與大配子體的形態(tài)鑒別大滋養(yǎng)體：大小一般不超過被寄生的紅細(xì)胞的3/4。核一個(gè)或延長(zhǎng)呈帶狀，周圍不著色帶不明顯。胞漿邊緣不整齊，有時(shí)有空泡。在厚血膜上表現(xiàn)有活動(dòng)性，故形態(tài)變化很大，胞漿收縮不均勻，有時(shí)斷裂成團(tuán)塊，瘧色素分布凌亂。大配子體：大小幾乎充滿真?zhèn)€紅細(xì)胞。核一個(gè)，較緊密，常偏于一側(cè)，周圍有一圈不染色帶。胞漿邊緣整齊，無空泡。瘧色素平均散在分布。在厚血膜上則體形較小，胞漿收縮均勻，不染色帶明顯，瘧色素分布規(guī)則沿

13、邊分布。43裂殖子與血小板的形態(tài)鑒別血小板：由骨髓巨噬細(xì)胞成熟脫落后解離而成，因此結(jié)構(gòu)松散，嚴(yán)格地說不是個(gè)完整細(xì)胞（無核）。在吉氏染色中多見顯淡紅色或淡紫色，中間顆粒為紫紅色，形狀近似石榴子，且邊緣不甚光滑。裂殖子：由成熟裂殖體破裂逸出，以致類似血小板聚集一起，或單個(gè)、或三五成群，但形體較血小板小，直徑0.7-1.8微米。核較大，相對(duì)的難見到胞漿，核染深紅色或紫紅色，四周胞漿圍繞，染藍(lán)色，呈卵園形，邊緣光滑。如附近查有瘧色素顆粒是有力的佐證。44厚血膜中瘧原蟲形態(tài)與鑒別 厚血膜由于用血量多，細(xì)胞重疊，干燥緩慢，以致蟲體皺縮，空泡消失，胞質(zhì)變形，加之紅細(xì)胞溶解，所以蟲種和蟲體的鑒別比薄血膜困難4

14、5厚血膜鑒別要點(diǎn)在厚膜中必須根據(jù)瘧原蟲的核、胞漿、瘧色素三個(gè)條件鑒別是否是瘧原蟲及何種蟲種。在一般情況下，具備三條中的二條也能給以判定。有時(shí)因染色較淺，不見原蟲的核和胞漿，只見到典型的瘧色素可斷定。僅見到核和少許胞漿，或者因染液過偏酸性連胞漿也看不清楚，同時(shí)又不見色素，但是只要對(duì)被染血膜的顏色、紅細(xì)胞的殘影、瘧原蟲所處的背景加以綜合分析，仍可正確做出判斷。4647雜質(zhì)與瘧原蟲的鑒別疑似瘧原蟲核與瘧原蟲的鑒別疑似瘧色素與瘧原蟲的鑒別疑似瘧原蟲胞質(zhì)與瘧原蟲的鑒別48疑似瘧原蟲與瘧原蟲核的鑒別細(xì)菌尤其是球菌或白細(xì)胞破裂后散出的顆粒，皆為紅色小點(diǎn)，最易混淆。但球菌形體較大，邊緣光滑，常多見聚集一處，分

15、布較廣。嗜中性和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒，著色較淡，邊緣整齊，附近常有白細(xì)胞的碎屑。49疑似瘧色素與瘧原蟲的鑒別 血膜上的染料殘?jiān)盎覊m，有時(shí)被誤認(rèn)為瘧色素，可依據(jù)顆粒的大小，色澤及分布范圍加以區(qū)別。轉(zhuǎn)動(dòng)顯微鏡微調(diào)時(shí)，可見其浮于紅細(xì)胞上，與瘧原蟲不在一個(gè)平面。50疑似瘧原蟲胞質(zhì)與瘧原蟲的鑒別網(wǎng)織紅細(xì)胞殘留物和白細(xì)胞殘留物通常為藍(lán)色，與瘧原蟲的胞質(zhì)相似，如與某些紅點(diǎn)結(jié)合在一起，易被誤認(rèn)為是瘧原蟲。鑒別時(shí)如形同大滋養(yǎng)體，可依據(jù)瘧色素的特點(diǎn)加以區(qū)別；如形狀似小滋養(yǎng)體，可依據(jù)蟲體大小、折光是否均勻以及核與胞質(zhì)是否在一個(gè)平面上予以區(qū)別。5152四種瘧原蟲圖譜53間日瘧原蟲形態(tài)54惡性瘧原蟲形態(tài)55三日瘧原蟲形態(tài)

16、56卵形瘧原蟲形態(tài)57血片鏡檢（要點(diǎn)）在學(xué)習(xí)鏡檢瘧原蟲之前，必須首先對(duì)正常厚薄血膜中各種血細(xì)胞的形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和染色性質(zhì)加以識(shí)別。鏡檢瘧原蟲，首先看薄血膜，在基本掌握薄血膜中瘧原蟲形態(tài)后，再學(xué)習(xí)鏡檢厚血膜。鏡檢瘧原蟲一般只查厚血膜，薄血膜只作為原蟲分類時(shí)參考和血片編號(hào)之用。鏡檢瘧原蟲須用油鏡頭配合5低倍目鏡鏡檢，當(dāng)發(fā)現(xiàn)疑難問題時(shí)，再調(diào)換10目鏡進(jìn)行觀察。檢查時(shí)應(yīng)從厚血膜的上緣開始，從上而下，從左到右，一行接一行，一個(gè)視野稍疊一個(gè)視野順序地看完整個(gè)厚血膜。一般情況下，每張厚血膜應(yīng)觀察至少100個(gè)視野或檢查時(shí)間不少于20分鐘。58血片鏡檢（結(jié)果記錄）看完血片后，若為陽(yáng)性，應(yīng)立即按血片編號(hào)登記原蟲的

17、種、期，以防差錯(cuò)。為檢查后記錄結(jié)果方便，對(duì)瘧原蟲的種、期可使用英文字母縮寫作為代號(hào)。間日瘧 P.v惡性瘧 P.f三日瘧 P.m卵形瘧 P.o環(huán)狀體 R大滋養(yǎng)體 T裂殖體 S配子體 G 59血片鏡檢（原蟲密度計(jì)數(shù)）半定量計(jì)數(shù)厚血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù)薄血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù)60 國(guó)內(nèi)常用此方法將密度分為6級(jí)：全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲，記錄“少”；100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野15個(gè)，記錄“”；100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野610個(gè)，記錄“+”；100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野11100個(gè)，記錄“+ ”；

18、100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野100個(gè)以上，記錄“+ ”。原蟲密度計(jì)數(shù)（半定量計(jì)數(shù) ）61原蟲密度計(jì)數(shù)（厚血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù)） 在制作厚血膜的同時(shí)，計(jì)數(shù)每l血中白細(xì)胞數(shù)。然后鏡檢厚血膜，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的瘧原蟲數(shù)和白細(xì)胞數(shù)，瘧原蟲密度較高時(shí)計(jì)數(shù)100200個(gè)白細(xì)胞即可，密度很低時(shí)計(jì)數(shù)1 000個(gè)。用下式算出瘧原蟲密度。瘧原蟲數(shù) 白細(xì)胞數(shù) 每l血中白細(xì)胞數(shù) = 瘧原蟲數(shù)/l血。如果無法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，則以6 000個(gè)白細(xì)胞 / l 血計(jì)算。62舉例假設(shè)計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞中有35個(gè)瘧原蟲，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血6000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲密度為35（原蟲數(shù)）200（白細(xì)胞數(shù)）6000=1050/微升答：該患者原蟲密度為1050/微升原蟲密度計(jì)數(shù)（厚血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù) ）63原蟲密度計(jì)數(shù)（薄血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù) ）在涂制薄血膜的同時(shí)，計(jì)數(shù)每l血液中的紅細(xì)胞數(shù)，也可按男性500萬個(gè)、女性按450萬個(gè)/l血計(jì)算。鏡檢薄血膜，算出紅細(xì)