生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件

1、 1869年Miescher博士論文工作中測定淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組成時, 發(fā)現(xiàn)了不溶于稀酸和鹽溶液的沉淀物, 并在所有細(xì)胞的核里都找到了此物質(zhì), 故命名核質(zhì)(Nuclein)。一、核酸研究簡史 1879年Kossel經(jīng)過10年的努力, 搞清楚核質(zhì)中有四種不同的組成部分: A,T, C和G。 1889年Altman建議將核質(zhì)改名為“核酸”, 并且已經(jīng)認(rèn)識到“核質(zhì)” 乃“核酸” 與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。 1869年Miescher博士論文工作中測定淋巴細(xì)胞 1909年Levene發(fā)現(xiàn)酵母的核酸含有核糖。 1930年Levene發(fā)現(xiàn)動物細(xì)胞的核酸含有一種特殊的核糖即脫氧核糖, 得出了一個錯誤概念: 植物核酸含

2、核糖,動物核酸含脫氧核糖。這個錯誤概念一直延續(xù)到1938年，這時方清楚RNA和DNA的區(qū)別。Levene還提出了核酸的“磷酸-核糖(堿基)-磷酸”的骨架結(jié)構(gòu), 解決了DNA分子的線性問題, 還在1935年提出“四核苷酸”學(xué)說, 認(rèn)為這四種核苷酸的聚合體是構(gòu)成核酸的基本單位。 1909年Levene發(fā)現(xiàn)酵母的核酸含有核糖。 1944年Avery重做1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗，證明DNA是遺傳物質(zhì)。 1952年Hershey & Chase的噬菌體感染實驗進(jìn)一步證明DNA是遺傳物質(zhì)。 1944年Avery重做1928年Griffith的 1950年Chargaff,E和Hotchki

3、ss,R.D.采用紙層析法仔細(xì)分析了DNA的組成成分, 得知A=T, G=C, A+G=C+T 1953年Watson, Crick根據(jù)DNA的X射線圖譜的研究結(jié)果, 提出了DNA的雙螺旋模型(Double helix)。幾星期后提出了半保留式復(fù)制模型。 1957年Meselson Stahl用密度梯度超離心法, 證實半保留復(fù)制假說。 1958年Kornberg得到高純度的DNA polymerase, 這種酶需要一個模板DNA。 1960年Cairns拍攝了復(fù)制中的細(xì)菌DNA的電鏡照片。 1970年發(fā)現(xiàn)第一個DNA限制性內(nèi)切酶。 1972年建立DNA重組技術(shù)。 1978年建立DNA的雙脫氧測

4、序法。 1990年開始實施人類基因組計劃。 2003年人類基因組計劃宣告完成測序任務(wù)。 1950年Chargaff,E和Hotchkiss,二、核酸的生物功能 (一) DNA是主要的遺傳物質(zhì) 1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗二、核酸的生物功能 1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗 1944年Avery重做1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗，證明DNA是遺傳物質(zhì)。但人們對此持懷疑態(tài)度，理由是： （1）因認(rèn)為蛋白相對分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA相對分子質(zhì)量小，只含4種不同的堿基，人們一度認(rèn)為不同種的有機(jī)體的核酸只有微小的

5、差異。 （2）認(rèn)為轉(zhuǎn)化實驗中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。 （3）即使轉(zhuǎn)化因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成起著直接的化學(xué)效應(yīng)，而不是充當(dāng)遺傳信息的載體。 1944年Avery重做1928年Griffith的1952年Hershey and Chase的實驗進(jìn)一步證明DNA是遺傳物質(zhì)1952年Hershey and Chase的實驗進(jìn)一步證明物種基因組基因數(shù)目物種基因組基因數(shù)目MS2噬菌體 3.6 kb4裂殖非洲粟酒酵20 Mbp6,000Q噬菌體 4.2 kb3盤基網(wǎng)柄菌47 Mbp7,000SV405.2 kbp8秀麗隱桿線蟲100 Mbp19,100X1745.4 k

6、bp9擬南芥70 Mbp25,500TMV 6.4 kb4水稻(秈稻)74. 8 Mbp46,02255,615HIV 9.3 kb10黑腹果蠅165 Mbp13,000腺病毒235.9 kbp11河豚魚400 Mbp70,000噬菌體48.5kbp50擔(dān)尼魚1.9 Gbp70,000T4噬菌體169 kbp300非洲爪蟾2.9 Gbp70,000大腸桿菌4.64 Mbp4,288小鼠3.3 Gbp70,000釀酒酵母13.5 Mbp5,885人3.3 Gbp31,000(二) DNA和基因組1.DNA和基因組 DNA分子中最小的功能單位稱作基因，為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因稱結(jié)構(gòu)基因，只有調(diào)節(jié)

7、功能，不轉(zhuǎn)錄生成RNA的稱調(diào)節(jié)基因，某生物體所含的全部基因稱該生物體的基因組。物種基因組基因數(shù)目物種基因組基因數(shù)目MS2噬菌體 3.62.原核生物基因組的特點 通常只有一個DNA分子；無重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因常構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位；有重疊基因。2.原核生物基因組的特點3.真核生物基因組的特點 （1）有重復(fù)序列，中度重復(fù)序列可重復(fù)幾十次到幾千次，如rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白質(zhì)的基因；高度重復(fù)序列可重復(fù)數(shù)百萬次，如衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。 （2）有斷裂基因，不少基因含有稱作內(nèi)含子的非編碼區(qū)，編碼區(qū)稱作外顯子，有些基因可含有幾十個內(nèi)含子。雞卵清蛋白的基因3.真核生物基因組的特點雞卵清蛋白的

8、基因人類基因組序列的類型長分散元件（6-8kb，約85萬個）短分散元件（0.1-0.3kb，約150萬個，其中Alu元件超過100萬個）簡單序列重復(fù)大片段重復(fù)人類基因組序列的類型長分散元件（6-8kb，約85萬個）短分生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(二) RNA功能的多樣性1.某些病毒的遺傳物質(zhì);2.控制蛋白質(zhì)的合成;3.遺傳信息的加工;4.基因表達(dá)和細(xì)胞功能的調(diào)控;5.催化功能;6.在細(xì)胞分化和個體發(fā)育中發(fā)揮重要作用;7.在生命起源中可能有重要作用?；疽?.熟悉核酸的發(fā)現(xiàn)和研究簡史。2.掌握核酸的種類、分布和生物功能。（重點）(二) RNA功能的多樣性基本要求第13章 核酸的結(jié)構(gòu) 第13章

9、 核酸的結(jié)構(gòu) 一、核苷酸 核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和堿基，堿基可以分成多種類型。 (一) 堿基 一、核苷酸生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件 與氨基酸一樣，堿基在細(xì)胞中也受到各種各樣的修飾，其產(chǎn)物常常扮演信號傳導(dǎo)信使分子、營養(yǎng)因子、輔酶等角色，并對核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著重要作用. 與氨基酸一樣，堿基在細(xì)胞中也受到各種各樣的修生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件內(nèi)酰胺內(nèi)酰亞胺內(nèi)酰胺內(nèi)酰亞胺(二) 核苷 (二) 核苷 生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(三) 核苷酸(三) 核苷酸生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件二、核酸的共價結(jié)構(gòu) (一)核酸中核苷酸的連接方式 二、核酸的共價結(jié)構(gòu)

10、核酸的一級結(jié)構(gòu)： 堿基的排列順序DNA 5- ATGCATGC3 3- TACGTACG3RNA 5- AUGCAUGC3核酸的二級結(jié)構(gòu)： 形成雙螺旋和單鏈環(huán)核酸的三級結(jié)構(gòu)： 空間構(gòu)象核酸的結(jié)構(gòu)層次核酸的一級結(jié)構(gòu)：核酸的結(jié)構(gòu)層次(二) DNA的一級結(jié)構(gòu)(三) RNA的一級結(jié)構(gòu)ACTG(二) DNA的一級結(jié)構(gòu)(三) RNA的一級結(jié)構(gòu)ACTG三、DNA的高級結(jié)構(gòu) (一) DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則，見表13-5(二) DNA的二級結(jié)構(gòu) 依據(jù)：Chargaff規(guī)則；X衍射圖；堿基不可滴定。三、DNA的高級結(jié)構(gòu) 要點（1）兩條鏈反向平行，繞同一軸相互纏繞成右手螺旋；（2）磷酸和戊糖交替處于螺

11、旋外圍，堿基處于內(nèi)部，形成堿基對；(3) 雙螺旋的直徑為2nm，堿基堆積距離為0.34nm；（4）一條鏈的核苷酸序列可以決定另一條互補(bǔ)鏈的核苷酸序列。* 要點（1）兩條鏈反向平行，繞同一軸相互纏繞成右手螺旋生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件Watson-Crick的DNA雙螺旋Watson-Crick的DNA雙螺旋生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件 雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直。 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵、堿基堆積力（即疏水作用）和環(huán)境中正離子的作用。 雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直 堿基的配對使得雙螺旋DNA分子在復(fù)制時以半保留的形式進(jìn)行。

12、堿基的配對使得雙螺旋DNA分子在復(fù)制時以半保留的形式5.DNA雙螺旋分子結(jié)構(gòu)的不同類型： 主要有三種，分別命名為A、B和C型。其中B型與Watson-Crick提出的模型一致，A和C型在低相對濕度的條件下形成，它們的螺距都比B型要短，A型DNA的結(jié)構(gòu)與DNA和RNA的雜合鏈相似。Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中發(fā)現(xiàn)，后用抗體證明天然DNA中也有，它是一種左手螺旋，在細(xì)胞中可能與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。 螺距 殘基數(shù) 堿基傾斜 A型(75%,Na) 2.8 11 20B型(92%,Na) 3.4 10 0C型(66%,Li) 3.1 9.3 6D/R hybrid 2.8 11 20Z型 4

13、.6 12 95.DNA雙螺旋分子結(jié)構(gòu)的不同類型： Z-DNA的結(jié)構(gòu)特點： （1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。 （2）左旋。 （3）G的糖苷鍵呈順式(Syn) ，使G殘基位于分子表面。 （4）大溝消失，小溝窄而深。 （5）每個螺旋有12bp。ZDNA存在的條件： （1） 高鹽：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L （2） Pu,Py相間排列。 （3）在活細(xì)胞中如果有m5C,則無需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下可產(chǎn)生Z型將結(jié)構(gòu)。 （4） 在體內(nèi)多胺化合物，如精胺和亞胺及亞精胺等陽離子，可和磷酸基因結(jié)合，使B-DNA轉(zhuǎn)變成Z-DNA。 （5）某些蛋白質(zhì)如Z-D

14、NA結(jié)合蛋白帶有正電荷，可使DNA周圍形成局部的高鹽濃度微環(huán)境。 （6）負(fù)超螺旋的存在。Z-DNA的結(jié)構(gòu)特點：Z-DNA的生物學(xué)意義 (1) 可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識別位點。嚙齒類動物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。 (2)原生動物纖毛蟲，有大、小兩個核，大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核與繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。Z-DNA的生物學(xué)意義生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件*6.DNA分子的三螺旋結(jié)構(gòu)和單鏈結(jié)構(gòu)： 在DNA分子中，鏡像重復(fù)

15、序列可以回折，形成三螺旋結(jié)構(gòu)。 在某些病毒中，DNA分子以單鏈形式存在。*6.DNA分子的三螺旋結(jié)構(gòu)和單鏈結(jié)構(gòu)：正螺旋和負(fù)螺旋負(fù)超螺旋 右旋正超螺旋 左旋 DNA雙螺旋為右手螺旋。細(xì)胞中的環(huán)狀DNA一般呈負(fù)超螺旋，即右手螺旋不足導(dǎo)致部分堿基不能形成配對，分子通過整體拓?fù)鋵W(xué)上的右旋來補(bǔ)足右手螺旋的不足，在數(shù)學(xué)上呈1：1，即分子整體右旋一圈來補(bǔ)雙螺旋上的一圈不足。 正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度，通過分子整體的左旋來解開過度的螺旋。(三 ) DNA的三級結(jié)構(gòu) 正螺旋和負(fù)螺旋負(fù)超螺旋正超螺旋 DNA雙螺旋為右手螺旋White方程： L=T+W L（Linking nnmber）：連環(huán)數(shù)或稱拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)，指c

16、ccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點是：(1)L是整數(shù)；(2) 在 cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；（3）右手螺旋的L取正值。 W（Writhing number）：扭曲數(shù)，即超螺旋數(shù)。其特點是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手超螺旋的W取負(fù)值。 T（Twisting number）：纏繞數(shù)，即雙螺旋的圈數(shù)。其特點是：(1) 可以是非整數(shù)；(2) 是變量；(3) 右手螺旋時T為正值。 超螺旋的量度可以用超螺旋密度來表示： =（L-T）/T 在天然DNA中，約為-0.05，大約20個雙螺旋有1個超螺旋。White方程： L=T+W促旋酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）的作用方式促旋

17、酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）的作用方式生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(四) DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu) (四) DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu) 平均每200bp的DNA繞核小體左旋1.75轉(zhuǎn)，因此真核生物的DNA分子為正超螺旋核小體的電鏡照片平均每200bp的DNA繞核小體左旋1.75轉(zhuǎn)，因此真核生物組蛋白八聚體：（a)前面觀；(b)頂面觀；（c）沿著染色體纖維長軸的透視圖；(d)DNA與組蛋白空間結(jié)構(gòu)的模式圖。（a)核小體的結(jié)構(gòu)圖，左圖為沿核小體軸觀察的圖示； 右圖為沿核小體軸垂直方向觀察的圖示；(b) 一半核小體的結(jié)構(gòu)圖。組蛋白八聚體：（a)前面觀；(b)頂面觀；（c）沿著染色體纖生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課

18、件四、RNA的高級結(jié)構(gòu) (一) tRNA的高級結(jié)構(gòu) 四、RNA的高級結(jié)構(gòu) 生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(二) rRNA的高級結(jié)構(gòu) 16S rRNA(二) rRNA的高級結(jié)構(gòu) 16S rRNA生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(三) 其他RNA的高級結(jié)構(gòu) (三) 其他RNA的高級結(jié)構(gòu) 基本要求1.掌握核苷酸的結(jié)構(gòu)特點和重要核苷酸的生物學(xué)功用。（重點）2.掌握核酸的共價結(jié)構(gòu)。（重點）3.掌握DNA的二級結(jié)構(gòu)，熟悉DNA的三級結(jié)構(gòu)。（重點）4.掌握RNA的二級結(jié)構(gòu)，熟悉RNA的三級結(jié)構(gòu)。 （重點）作業(yè)題第500頁第3題；第500頁第4題；第500頁第5題；第500頁第6題；第5

19、00頁第7題；第500頁第10題；第500頁第12題；第500頁第13題；第500頁第14題?；疽笞鳂I(yè)題 第14章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì) 第14章 一、核酸的水解(一) 酸水解 糖苷鍵比磷酸酯鍵更易水解，特別是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵很容易水解。(二) 堿水解 通常用于RNA水解，DNA的堿水解比較困難。一、核酸的水解生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(三) 酶水解(三) 酶水解生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件 雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme）切斷, 又可以再連接起來。切斷的過程不需要能量，而連接的起來的過程卻需要2個分子的ATP。這

20、就是分子克隆和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。DNA與限制性內(nèi)切酶 雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性大部分限制性內(nèi)切酶識別的堿基序列為4 6 個堿基的palindrome 順序。它們在微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮iu的是防御外來DNA入侵的國防軍的作用。大部分限制性內(nèi)切酶識別的堿基序列為4 6 個堿基的pali堿基adenine 4.15, 9.8cytosine 4.5, 12.2guanine 3.2, 9.6thymine 9.9, 13核苷adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3

21、, 13guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13核苷酸AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4ADP 3.9, 6.3 : -CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0二、核酸的酸堿性質(zhì) 堿基配對時堿基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 堿基中的H原子一般不移動，因此很少有亞氨基團(tuán)。 在中性pH條件下，參與氫鍵的-NH2基均不帶電荷，這是雜環(huán)電子共軛以及氫鍵共同作

22、用的結(jié)果，否則雙螺旋結(jié)構(gòu)不會穩(wěn)定。堿基、核苷、核苷酸的pK值堿基二、核酸的酸堿性質(zhì)堿基、核苷、核苷酸的pK值生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 DNA分子的變性四、核酸的變性，復(fù)性及雜交變性和復(fù)性的含義DNA分子的變性四、核酸的變性，復(fù)性及雜交變性和復(fù)性的含義DNA的變性在紫外吸收上的變化Tm的定義影響Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的溫度范圍越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，當(dāng)GC的含量上升1%，則Tm上升0.4。馬默多蒂（M

23、armur-Doty）關(guān)系式：Tm = 69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）2.44 3.介質(zhì)的離子強(qiáng)度較高時, Tm的值較大。 4.酸性條件下,核酸容易脫嘌呤,堿性條件下,核酸容易變性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化學(xué)試劑可以降低Tm的值,稱作變性劑。DNA的變性在紫外吸收上的變化Tm的定義影響Tm的因素 SSC溶液，常用于DNA的溶解。SSC溶液，常用于DNA的溶解。生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件(二) 復(fù)性 T1/2 C constDNA濃度與復(fù)性時間的關(guān)系影響復(fù)性速度的因素1.DNA的片段越大,復(fù)性的速度越慢;2.DNA的濃度越高,復(fù)性的速度

24、越快;3.DNA的重復(fù)序列越多,復(fù)性的速度越快;4.溶液的pH過高或過低,復(fù)性的速度均會降低;5.適當(dāng)增高溶液的離子強(qiáng)度,復(fù)性的速度會增高。(二) 復(fù)性 T1/2 C constDNA濃度與復(fù)DNA復(fù)性與Cot分析當(dāng) C/C0=1/2時， k=1/C0t1/2DNA復(fù)性與Cot分析當(dāng) C/C0=1/2時， k= 哺乳動物的DNA 一般均呈右圖的曲線，這是因為它們的基因組DNA 中插入了大量的重復(fù)序列，如人的DNA中就插入了長度為350bp的Alu序列達(dá)50萬份拷貝之多。人DNA的Cot曲線 哺乳動物的DNA 一般均呈右圖的曲線，這是因(三) DNA的分子雜交技術(shù) 分子雜交是將不同來源的核酸分子

25、分別變性，再混合后復(fù)性，使不同來源的單鏈的互補(bǔ)區(qū)形成雙鏈的技術(shù)。 通常將其中的一方用放射性同位素或特定的基團(tuán)(如生物素,地高辛)標(biāo)記，稱作探針，現(xiàn)時的探針多為人工合成的短片段。 若將雜交的另一方直接點到膜上進(jìn)行雜交，稱作點雜交。對組織切片或菌落進(jìn)行處理后再雜交稱作原位雜交。 分子雜交的廣泛應(yīng)用是將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，進(jìn)行變性凝膠電泳，將凝膠電泳形成的DNA區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進(jìn)行雜交，這種技術(shù)稱作Southern雜交。將RNA凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進(jìn)行雜交稱作Northern雜交。將蛋白質(zhì)凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱作Western印跡技

26、術(shù)。將蛋白質(zhì)等點聚焦形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱作Eastern印跡技術(shù)。 分子雜交技術(shù)在現(xiàn)代生命科學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。 將人工合成的探針用點樣機(jī)點到玻璃或塑料基片上形成高密度的陣列，將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，變性后用熒光基團(tuán)標(biāo)記，再進(jìn)行分子雜交操作，這就是DNA芯片技術(shù)的基本原理。用類似的技術(shù)可以制成蛋白質(zhì)芯片。按指令在基片上合成探針，可以制成密度特別高的芯片。 生物芯片技術(shù)有非常廣闊的應(yīng)用前景。(三) DNA的分子雜交技術(shù) 分子雜交是將不同來源的生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件基本要求1.熟悉核酸的

27、水解方法及水解產(chǎn)物。2.掌握核酸的酸堿性質(zhì)。（重點）3.掌握核酸的紫外吸收。（重點）4.掌握核酸變性、復(fù)性及雜交的有關(guān)知識及應(yīng)用。（重點、難點）基本要求 第15章 核酸的研究方法 第15章 一、核酸的分離、提純和定量測定 (一) DNA的分離 用1mol/L的NaCl制備組織勻漿,離心除去組織殘渣,多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性,每次處理后離心取上層水相,最后加2倍體積的乙醇沉淀出DNA。(二 ) RNA的分離 由于RNA酶存在廣泛,且十分穩(wěn)定,破碎細(xì)胞時要加入胍鹽破壞RNA酶,試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC處理,多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變

28、性,每次處理后離心取上層水相,mRNA可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA中分離。(三) 核酸含量的測定法 常用的方法是測定260nm的消光度,用公式計算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法測定。 DNA的含量可以用二苯胺顯色法測定。 RNA的含量可以用地衣酚顯色法測定。一、核酸的分離、提純和定量測定 (一) DNA的分離（四）核酸的超速離心 (圖15-2) 超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大） ,線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。（五）核酸的凝膠電泳 (圖15-3)松弛型，OC, Open circular DNA超螺旋, CCC, covalently-

29、closed circular DNA從細(xì)菌抽提得到的質(zhì)粒DNA 樣品中不含線狀DNA（四）核酸的超速離心 (圖15-2)松弛型，OC, Open二、核酸的核苷酸序列測定和化學(xué)合成 二、核酸的核苷酸序列測定和化學(xué)合成 (一) DNA的酶法（末端終止法）測序 (一) DNA的酶法（末端終止法）測序 (二) DNA的化學(xué)法測序(二) DNA的化學(xué)法測序生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件生物化學(xué)核酸化學(xué)醫(yī)學(xué)知識課件DNA酶法測序自動化 使用4種熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，毛細(xì)管電泳和激光掃描技術(shù)使測序自動化，一個泳道一次可測大約1000個核苷酸，測序已成為可以快速完成的常規(guī)技術(shù)。人類基因組測序已經(jīng)完成，多態(tài)

30、性的研究和功能基因組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點。DNA酶法測序自動化由于測序儀在一個泳道只能準(zhǔn)確測出幾百個核苷酸，對于長DNA, 只能將其切成小段再測序，為了組裝，需要確定足夠多的標(biāo)記位點。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(STS)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等方法確定標(biāo)記位點。限制性酶切位點分析是繪制物理圖的常用方法由于測序儀在一個泳道只能準(zhǔn)確測出幾百個核苷酸，對于長DNA,(三) RNA的測序 1.RNA的測序可以用4種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNase A水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNase T1水解鳥苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的RNase U2水解腺苷酸的磷酸二

31、酯鍵，多頭黏菌中提取的RNase Phy 水解A、U、G三種核苷酸的磷酸二酯鍵）,凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。 2.也可以用化學(xué)試劑斷裂RNA鏈，用類似DNA化學(xué)測序的方法推斷核苷酸序列。 3.最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA測序的方法推斷核苷酸序列。(三) RNA的測序 1.RNA的測序可以用（四）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理 PCR (polymerase chain reaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板DNA的含量依指數(shù)方式增加，可用來快速在體外擴(kuò)增DNA, PCR技術(shù)在臨床檢驗和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動了

32、這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。（四）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理 PCR (polymPCR技術(shù)的擴(kuò)展 典型的PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴(kuò)展到分子生物學(xué)的各個方面，較常用的技術(shù)擴(kuò)展有：1. “巢式”PCR(nested PCR) 先用一對引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對引物擴(kuò)增第一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一PCR 技術(shù)即巢式PCR。第一次擴(kuò)增所用引物稱外引物(outer-primer)，第二次擴(kuò)增作用的引物稱內(nèi)引物(inter-primer)。 進(jìn)行“巢式”PCR可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少，用外引物進(jìn)行時，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增。

33、經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的PCR擴(kuò)增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進(jìn)退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。 “巢式”及“中途進(jìn)退式”PCR主要用于極少量模板的擴(kuò)增。 PCR技術(shù)的擴(kuò)展2. 復(fù)合PCR(multiplex PCR) 在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。3. 不對稱PCR(asymmetric PCR) 兩種引物比例相差較大的PCR稱不對稱PCR。不對稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。4. 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR) 由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為RNA時，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生