S2株布氏桿菌減毒活疫苗免疫效果觀察

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2、于牛、豬、羊，是引起人類布氏桿菌病的主要 傳染源。為此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(ole)將布氏桿菌病列為b類動(dòng)物疫 病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病，是國際貿(mào)易衛(wèi)生檢疫中必檢的傳染病。20XX年1012月期間，xx規(guī)模養(yǎng)殖場先后從天津、唐山、西安 引進(jìn)奶牛258頭，與本地奶牛混群飼養(yǎng)。隨著奶牛的大量異地調(diào)運(yùn)， 布病疫情出現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)。20XX年6月至11月，布病感染陽性 奶牛的比例從0.85%上升至U 5.89%,根據(jù)檢疫結(jié)果將布病感染陽性奶 牛強(qiáng)行撲殺，然而通過撲殺的措施并沒有取得滿意的效果。在混群飼 養(yǎng)的規(guī)模養(yǎng)殖場中，處于布病感染潛伏期的奶牛數(shù)量較大。至20XX 年2月再次進(jìn)行檢疫時(shí)，奶牛群虎紅

3、平板凝集陽性率高達(dá)30.88%； 試管凝集試驗(yàn)陽性率達(dá)到22.99%。從20XX年11月10日20XX年2 月11日，在3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)感染牛群中44頭奶牛發(fā)生了流產(chǎn)、死胎 的癥狀，其中虎紅平板凝集陽性奶牛39頭，占88.64%；試管凝集陽 性奶牛31頭，占70.45%。上述檢疫結(jié)果證實(shí)，該規(guī)模養(yǎng)殖場發(fā)生了 布氏桿菌野生強(qiáng)毒株的侵襲和蔓延。嚴(yán)峻的布病疫情不僅制約了奶牛 業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且威脅著牛乳及其乳制品的安全，成為影響民生 的一件大事。我國對(duì)家畜布氏桿菌病采取以檢疫凈化為主的綜合防控 措施，同時(shí)包括對(duì)重點(diǎn)疫區(qū)的易感動(dòng)物接種疫苗，待臨床病例逐漸減 少和疫情得到有效控制以后，再實(shí)施群體和地域的

4、凈化1。為此，對(duì) 該規(guī)模養(yǎng)殖場實(shí)施布病檢疫、分群隔離和免疫接種的綜合防控方案， 現(xiàn)將奶牛接種s2株布氏桿菌減毒活疫苗的免疫效果報(bào)告如下。1材料與方法試劑、疫苗布病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和試管凝集試驗(yàn)抗原 購自青島易邦生物工程有限公司，在有效期內(nèi)使用，按 gb/T1864620XX規(guī)定的程序操作；s2株布氏桿菌活疫苗購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠， 每瓶含布氏桿菌弱毒活菌4000億cFu，用生理鹽水稀釋疫苗，每頭 奶?？诜臃N500億活菌劑量，采取投藥器噴注到牛舌根及咽喉部免 疫。試驗(yàn)牛根據(jù)對(duì)奶牛群的布病檢疫結(jié)果，將布病檢疫陰性牛定 為A組，口服免疫503頭；布病檢疫陽性牛（虎紅平板凝集或試

5、管凝 集陽性）定為b組，口服免疫223頭。兩組奶牛分群隔離飼養(yǎng)，實(shí)施 場地環(huán)境消毒。疫苗的安全性試驗(yàn)口服接種s2株布氏桿菌減毒活疫苗以后， 觀察記錄奶牛群的疫苗接種反應(yīng)。疫苗的免疫效果測(cè)定根據(jù)奶牛場的生產(chǎn)記錄，逐月統(tǒng)計(jì)疫苗 接種前后能繁母牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎癥狀的病例數(shù)，了解口服免疫對(duì)布 病感染牛群控制流產(chǎn)率的效果；口服接種活疫苗以后15d、30d、45d、 60d和90d，對(duì)A組和b組奶牛群按20%的比例隨機(jī)抽取血液樣本， 定性（虎紅平板凝集試驗(yàn)）和定量（試管凝集試驗(yàn)）檢測(cè)血清中的布氏桿 菌抗體水平，了解活疫苗誘導(dǎo)的抗體消長動(dòng)態(tài)。鮮乳樣本布氏桿菌核酸檢測(cè)10 xpcRbuffer、mgcl2、d

6、nTp、 TaqDnApolymerase、D200DnAmarker等購自大連寶生物工程有限公司。按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(nY/T146720XX),從鮮乳樣本提 取總DnA作為模板，針對(duì)布氏桿菌omp25基因合成內(nèi)外兩對(duì)引物， 采用嵌合式pcR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完成以后取5ulpcR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)以s2株布氏桿菌活疫苗作為陽性對(duì)照，滅 菌雙蒸餾水作為空白對(duì)照，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為419bp的DnA帶。2 結(jié)果疫苗的安全性試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ航臃Ns2株布氏桿菌減毒活疫苗以后， 無論是布病檢疫陰性牛(A組)還是布病檢疫陽性牛(b組)，均未觀察到 任何接種反應(yīng)，包括發(fā)熱、呼吸急

7、促、食欲下降、流產(chǎn)和死胎等癥狀。 結(jié)果表明s2株布氏桿菌減毒活疫苗口服接種是安全的。能繁母牛流產(chǎn)率的控制效果20XX年2月14日該奶牛場口服 接種s2株布氏桿菌減毒活疫苗，疫苗接種前后能繁母牛逐月統(tǒng)計(jì)的 流產(chǎn)率見圖1。圖1.能繁母牛發(fā)生流產(chǎn)死胎癥狀分月統(tǒng)計(jì)圖 8.00%7.00%6.00%5.00%4.00%3.00%2.00%1.00%0.00%7.34%4.09%3.41 %2.23%2.35%1.65%1.0312月1月2月3月4月5月6月圖1.疫苗接 種前后能繁母牛逐月統(tǒng)計(jì)的流產(chǎn)率接種疫苗以前3個(gè)月，布病感染奶牛場中能繁母牛的月平均流產(chǎn) 率達(dá)到4.55%，2月上旬出現(xiàn)流產(chǎn)高峰(7.34

8、%)；接種疫苗以后，能繁 母牛的月平均流產(chǎn)率降低至2.11%，目前控制在1%以下。試驗(yàn)結(jié)果 證實(shí)，s2株布氏桿菌減毒活疫苗能有效控制布病感染牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎的癥狀，減少能繁母牛因流產(chǎn)、死胎導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平A組奶牛(免疫前布病檢疫陰性)接 種疫苗以后，定期采集血清樣本檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的抗體水平，結(jié)果見表1。表1.A組奶牛免疫后布氏桿菌抗體消長動(dòng)態(tài)接種疫苗后平板凝集陽性率抗體效價(jià)回1： 100抗體效價(jià)=1 ：5015d30d45d60d90d29.7%(30/101)36%(46/100)31.1%(28/29)25%(25/1 00)24.5%(6.9%(7/101)9.0%(

9、9/100)8.9%(8/90)8.0%(8/100)8.0%(11.9%(1 2/101)14%(14/100)5.6%(5/90)8.0%(8/100)8.0%(A 組奶牛接種疫苗以后15d,即可檢出疫苗誘導(dǎo)的布氏桿菌抗體，29.7%的免疫牛顯現(xiàn)虎紅平 板凝集陽性(血清學(xué)轉(zhuǎn)換)；30d抗體水平達(dá)到高峰(36%)； 4590d抗 體陽性率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)(31.1%玲24.5%)。試管凝集定量檢測(cè)的 抗體效價(jià)較低，5.6%14%的血清樣本抗體效價(jià)為1： 50； 6.9%9.0% 的血清樣本抗體效價(jià)達(dá)到1： 100以上。試管凝集試驗(yàn)測(cè)定的抗體消 長動(dòng)態(tài)與虎紅平板凝集基本是一致的。監(jiān)測(cè)結(jié)果表明

10、，口服s2株布 氏桿菌減毒活疫苗誘導(dǎo)形成的血清抗體水平較低，消失也較緩慢。分群隔離飼養(yǎng)的b組奶牛免疫前布病檢疫陽性，接種疫苗以后 15d、30d、45d、60d和90d,虎紅平板凝集陽性率分別為95%(38/40)、 92.5%(37/40)、85%(34/40)、92.5%(37/40)和 82.5%(33/40)。 口月艮 s2 株 布氏桿菌減毒活疫苗以后，布病感染陽性牛出現(xiàn)了少數(shù)血清抗體轉(zhuǎn)陰 的現(xiàn)象。鮮乳樣本布氏桿菌核酸檢測(cè)結(jié)果從接種疫苗的A組奶牛不間斷隨機(jī)采集鮮乳樣本90份，按nY/T146720XX規(guī)定的程序操作，針 對(duì)布氏桿菌omp25基因進(jìn)行嵌合式pcR擴(kuò)增。結(jié)果見圖2。圖2.鮮

11、乳樣本的嵌合式pcR擴(kuò)增圖15：鮮乳樣本；6：滅菌雙蒸餾水空白對(duì)照；7： s2株布氏桿菌陽性對(duì)照；m： D200DnAmarker。s2株布氏桿菌活疫苗陽性對(duì)照顯現(xiàn)一條419bp的DnA帶，滅菌 雙蒸餾水空白對(duì)照不顯現(xiàn)任何條帶，4份被檢鮮乳樣本顯現(xiàn)一條 419bp的DnA帶，與預(yù)期擴(kuò)增長度相符合。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，免疫奶牛 鮮乳樣本中能夠檢出布氏桿菌核酸，檢出率為4.44%(4/90)。3討論根據(jù)我國對(duì)牲畜布病疫情的監(jiān)測(cè)結(jié)果分析，在80年代以前， 布病疫區(qū)主要集中在內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏和西藏五大牧區(qū)；從 90年代以后，牧區(qū)布病疫情依然嚴(yán)重，同時(shí)半農(nóng)半牧區(qū)和農(nóng)區(qū)省份 的布病疫情明顯上升2。20X

12、X年底，該規(guī)模養(yǎng)殖場從天津、唐山、 西安大量引進(jìn)奶牛，與本地牛群混合飼養(yǎng)，導(dǎo)致了布病疫情的流行和蔓延。由于養(yǎng)殖場中奶牛的布病感染率 (22.99%)和患病率(7.34%)較高，處于布病感染潛伏期的奶牛數(shù)量較大， 采取檢疫一撲殺一補(bǔ)償?shù)姆揽胤桨鸽y以實(shí)施，現(xiàn)階段對(duì)布病重點(diǎn)疫區(qū) 只能采取疫苗接種為主和檢疫撲殺為輔的防控策略。試驗(yàn)結(jié)果表明： 無論是布病檢疫陰性牛還是布病檢疫陽性牛，口服接種s2株布氏桿 菌減毒活疫苗均是安全的；免疫接種能夠防止健康陰性奶牛遭受布氏 桿菌的侵襲，有效控制布病感染奶牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎的癥狀，減少由 此導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。但是，疫苗接種是一種權(quán)宜之計(jì)，是目前控制重 點(diǎn)疫區(qū)布病流行的

13、一種方法。一旦奶牛群接種活疫苗以后，布病感染 的疫情被掩蓋了，而不是消失了，因?yàn)橐呙缃臃N動(dòng)物與自然患病動(dòng)物 無法甄別，法定檢疫措施嚴(yán)重受阻。另一方面，布氏桿菌是一種慢性 胞內(nèi)寄生感染，疫苗活菌在動(dòng)物體內(nèi)殘存的時(shí)間較長，對(duì)奶牛群構(gòu)成 潛在的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，s2株活疫苗對(duì)人體具有一定的毒性，對(duì)奶牛場的 飼養(yǎng)員、繁殖員和獸醫(yī)員形成潛在的威脅。根據(jù)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 防制布病的經(jīng)驗(yàn)，采用“s2株菌苗口服免疫為主的綜合性防制措施， 一年一次即可控制布病大面積流行，連續(xù)3年免疫達(dá)到完全控制布病， 通過加強(qiáng)檢疫、監(jiān)測(cè)和逐步淘汰，35年內(nèi)實(shí)現(xiàn)奶牛場凈化的目標(biāo)。在布氏桿菌疫苗接種過程中，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體主要以細(xì)胞免疫

14、為主，以體液免疫為輔。奶牛群口服免疫s2株活疫苗以后，血清抗 體陽性率達(dá)到24.5%36%,抗體效價(jià)較低。這一監(jiān)測(cè)結(jié)果與韓磊等 1描述的血清抗體消長規(guī)律比較相似，抗體陽性率的最高值出現(xiàn)在免 疫后1545d（平均30d）,抗體效價(jià)達(dá)到1： 501： 150；與風(fēng)英等3 測(cè)定的數(shù)據(jù)存在較大差異泌乳牛和育成牛免疫后20、25、30天的血 清效價(jià)都達(dá)到1： 400。對(duì)布病感染奶牛接種s2株活疫苗以后，風(fēng)英 等發(fā)現(xiàn)“感染牛群布病血清學(xué)陽性率沒有增加，反而一次降低了 28.3%。本試驗(yàn)也觀察到布病感染陽性牛少數(shù)（5%17.5%）血清抗體 轉(zhuǎn)陰的現(xiàn)象，陽性牛布病抗體轉(zhuǎn)陰的機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。mp25存在于所

15、有布氏桿菌中，是布氏桿菌主要外膜蛋白成 分之一；omp36主要存在于牛流產(chǎn)布氏桿菌(b.abortus)中，是構(gòu)成跨 膜通道的膜孔蛋白；omp31主要存在于羊馬爾它熱布氏桿菌 (b.melitensis)中，在綿羊附睪型布氏桿菌(b.ovis)和犬布氏桿菌(b.canis)中表達(dá)量也相對(duì)較高。按農(nóng)業(yè)行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)nY/T146720XX規(guī)定的程序操作，針對(duì)布氏桿菌omp25基因進(jìn) 行嵌合式pcR擴(kuò)增，有利于提高樣本中布氏桿菌的檢出率，保證布氏 桿菌核酸擴(kuò)增的屬特異性。溫富勇等采用布病乳汁環(huán)狀試驗(yàn)抗原檢測(cè) 86份免疫奶牛的鮮乳樣本，未檢出布氏桿菌特異性抗體，因此認(rèn)為 乳汁是安全的；風(fēng)英等采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)鮮乳樣本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查， 未分離到布氏桿菌，因此認(rèn)為布病陰性泌乳牛免疫后乳汁無排菌現(xiàn)象; 本試驗(yàn)從布病陰性奶牛免疫后采集的鮮乳樣本檢出布氏桿菌核酸，檢 出率為4.44%。關(guān)于疫苗接種奶牛是否存在乳汁排菌的風(fēng)險(xiǎn)，各地學(xué) 者持有不同的觀點(diǎn)，報(bào)告了不同的結(jié)果。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物布病防控 研究室吳清明指出，在布魯氏病流行和防控技術(shù)研究對(duì)策中，應(yīng)增加 動(dòng)物性食品布病病原體的基本檢測(cè)項(xiàng)目5。近年來隨著現(xiàn)代分子生物 學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者開始將多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(pcR)引用于 布氏桿菌核酸的檢測(cè)678。在本試驗(yàn)檢出的4份陽性鮮乳樣本中， 是存在活的布氏桿