蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1、2、 蛋白質(zhì)分離的雙向電泳過(guò)程21 溶液配制常用水化上樣緩沖液(I)尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50M (40%)溴酚藍(lán)0.00110M （1 %溴酚藍(lán)）MilliQ 水定容至 100ml(n)尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50Ml(40%)溴酚藍(lán)0.00110M （1 %溴酚藍(lán)）MilliQ 水定容至 100ml(川)尿素5M3.0g硫脲2M1.52gSB3-102%0.2gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Ly

2、te0.2%(w/v)50Ml(40%)溴酚藍(lán)0.00110M （1 %溴酚藍(lán)）MilliQ 水定容至 100ml分成 10 小管，每小管 1ml,-80c冰箱保存。膠條平衡緩沖液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.05M pH8.83.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)甘油20%20ml定容至 100mlMilliQ 定容至 100ml分裝成10管，-20 C冰箱保存膠條平衡緩沖液I膠條平衡緩沖液母液 10ml DTT 0.2g 充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。10ml0.25g膠條平衡緩沖液U 10ml0.25g充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液低熔點(diǎn)瓊脂糖 0.5T

3、ris甘氨酸低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液低熔點(diǎn)瓊脂糖 0.5Tris甘氨酸SDS溴酚藍(lán)MilliQ 水25mM192mM0.1%0.001 0.5g0.303g1.44g1ml(10%SDS) 100卩1（1%溴酚藍(lán)）定容至 100ml加熱溶解至澄清，室溫保存。30聚丙烯酰胺貯液丙烯酰胺150g甲叉雙丙稀酰胺4gMilliQ 水500ml濾紙過(guò)濾后，棕色瓶4C冰箱保存1.5mol/L Tris 堿 pH8.8Tris 堿90.75g500ml, 4 C冰箱保存500ml, 4 C冰箱保存用 1mol/L HCl 調(diào) pH 至 8.8 ，加 MilliQ 水定容至10% SDSSDS 10gMilliQ

4、水100ml10%S硫酸銨過(guò)硫酸銨0.1gMilliQ 水1ml現(xiàn)用現(xiàn)配。10X電泳緩沖液(1 x = 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3Tris 堿30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ 水1L混勻后，室溫保存。2操作步驟2.2.1第一向等電聚焦從冰箱中取水化上樣緩沖液，室溫溶解；在 enpendoff管中，2.0mg蛋白 干粉加入200訕?biāo)蠘泳彌_液，室溫下裂解 3-4h ; 10000rpm常溫離心10min, 取上清液上樣水化。具體的上樣體積及蛋白質(zhì)上樣量如下表，ReadyStrip TMIPG 膠條長(zhǎng)度上樣體積分析型的上樣量（銀染）制

5、備型的上樣量（考馬斯亮蘭染色）7 cm125-250 卩110-100ug200-500ug17cm300-600 卩1100-300ug1-3mg從冰箱中取-20 C冷凍保存的IPG預(yù)制膠條，于室溫放置10min。沿著聚焦盤(pán)的邊緣由左至右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣, 中間的樣品一定要連貫，同時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層，分清膠條的正負(fù)極，輕輕地 將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤(pán)中樣品溶液上，使得膠條得正極對(duì)應(yīng)于聚焦盤(pán) 得正極。確保膠條與電極緊密接觸，同時(shí)不要使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。在每根膠條上覆蓋礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。對(duì)好正、負(fù)

6、極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。7cm膠條水化12h（17-20 C） 主動(dòng)水化S1 250V慢速 2 h除鹽S2500V慢速S31000VS2500V慢速S31000V快速S44000V線性S54000V快速S6500V快速17c m膠條水化12hS1250V慢速S2500V慢速S31000V快速S48000V線性S58000V快速S6500V快速選擇所放置的膠條數(shù)。設(shè)置每根膠條的極限電流。設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。7. 聚焦結(jié)束的膠條如不立即進(jìn)行平衡、1 h除鹽1 h除鹽3 h升壓25000 伏 h 聚焦 任意時(shí)間保持(17-20 C)主動(dòng)水化2 h除鹽1 h除鹽1 h除鹽5 h升壓60,00

7、0 伏 h 聚焦任意時(shí)間保持第二向SDS- PAG電泳，可將膠條置于樣品水化盤(pán)中，-20 C冰箱保存1-2天第二向 SDS- PAGE電泳配制12%的丙稀酰胺凝膠，上部留0.5cm的空間，用MilliQ 水封面，保 持膠面平整。待凝膠凝固候， 倒去分離膠表面的 MilliQ 水，再用 MilliQ 水沖洗。從-20 C冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10min,使其溶解。在桌上先放置干得厚濾紙，聚焦好得膠條膠面朝上放在干得厚濾紙上。將 另一份厚濾紙用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后置于膠條上，輕輕吸干膠 條上得礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)得縱條紋。將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤(pán)中，每

8、個(gè)槽一根膠條，在槽中加入平衡緩沖液I。將 樣品水化盤(pán)放在搖床上緩慢搖晃 10-15min。第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉平衡緩沖液I,將膠條豎在濾紙上，吸去多余得平衡液。再加入膠條平衡緩沖液U,繼續(xù)在搖床上緩慢搖晃10-15min。用濾紙吸去SDSK丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余得液體。將處理 好的第二向凝膠放在桌面上， 長(zhǎng)玻璃板再下， 短玻璃板朝上， 凝膠的頂部對(duì)著自 己。第二次平衡結(jié)束后，用濾紙吸去膠條上多余的平衡液。用鑷子夾住膠條的 一端使膠面完全浸沒(méi)在1X電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻 璃板上。將放有膠條的SDS- PAG礙膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短板一面對(duì)著自己，在凝 膠的上方加

9、入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。用鑷子或平頭的針頭輕輕地將膠條向下推， 使之與聚丙烯酰胺膠膠面完全 接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡，同時(shí)操作時(shí)注意不要碰到膠面。放置5min，低熔點(diǎn)瓊脂糖圭寸膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。電泳起始時(shí)用低電流(7cm膠條：5-10mA/gel ; 17cm膠條：10mA/gel) 或低電壓(7cm膠條：50-75V/gel ; 17cm膠條75-100V/gel)，待樣品在完全走出 IPG膠條，濃縮成一條線后，在加大電流(7cm膠條：10-15mA/gel ; 17cm膠條： 20-30mA/gel)或電壓(7cm 膠條：150-200V/gel ; 17cm

10、膠條：300-400V/gel)，待 溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以做記號(hào)。然后進(jìn) 行染色。23 染色方法2.3.1考馬斯亮藍(lán)G-250染色固定液：45%( V/V)甲醇，1%( V/V)乙酸G-250染色液：17% (W/V 硫酸銨，34% (V/V)甲醇，0.5 % (V/V)乙酸，0.1 % ( W/V)G-250.步驟： 1. 固定液固定 20min 或過(guò)夜(無(wú)需固定液可) 。倒出固定液加入G-250染色液，18-24h。倒出染色液用水洗(20min 一次，4555 C溫水有助于水洗)可用塑料包裹，4 C貯于密封盆里。膠體考染法

11、用去離子水清洗凝膠兩次，每次 10min，以去除SDS固定：50%乙醇/10 %冰醋酸/的水溶液，至少30min,可過(guò)夜。染色：染色液為45%甲醇/10 %冰醋酸/0.25 % G-250溶液過(guò)濾所得，將凝 膠浸泡后染色至少 2h。脫色：多次更換脫色液( 25%乙醇/8%冰醋酸溶液)直至背景脫凈。保存：用保險(xiǎn)膜包裹，可存一個(gè)月。銀染法步驟 試劑體積( ml) 不同類型膠所需時(shí)間 (min)1mm 1.5mm1.固定 10 %乙酸 / 40 %乙醇 / 水 2 X 2502 X 152 X 602.敏化 75ml 乙醇 / 17g 乙酸鈉 /10ml 5% Na2S2O3 /1.25ml 戊二醛

12、 /250加水至30603. 水洗去離子水3 5X 2503X 155X84. 銀染25ml AgNO3 (2.5%) /100訕甲醛/加水至25020605. 水洗去離子水24X 2502X14X16. 顯色6.25g Na 2CO / 100 訕甲醛7 訕 NqSQ(5%)250467. 停止3.65g EDTA 加水至25010408. 水洗去離子水2 3X 2503X52X 303、 等電聚焦蛋白樣品的濃度檢測(cè)31 Bio-Rad RC DC Protein Assay微離心管檢測(cè)方法將5卩1 DC試劑S與250訕DC試劑A混合(試劑A),每份樣品或標(biāo) 準(zhǔn)溶液需要127卩1試劑A。(

13、2)將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋為 3-5 份蛋白濃度在 0.2-1.5mg/ml 范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在每次測(cè)未知蛋白濃度前繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (為得到最佳結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)蛋白應(yīng)與樣品 使用同樣的緩沖液)從每份樣品或標(biāo)準(zhǔn)蛋白中取出25卩1，分別加至清潔、干燥的微離心管 中。 向每管中加入125卩1 RC試劑I,混旋后室溫放置1mi n。向每管中加入125卩1 RC試劑U并混旋，之后在15, 000X g速度下離 心 3-5min 。( 6)吸去上清，然后將管子倒置在干凈吸水紙上，使溶液徹底被吸干。 向每個(gè)微離心管中加入127訕試劑A并混旋，在室溫下放置 5min 或直至沉淀徹底溶解。在進(jìn)行下一步之前再次混旋。在每個(gè)

14、管中加入1ml DC試劑B,立即混旋，室溫下放置15min。在750nm下讀取吸光度，吸光度測(cè)定要在1h內(nèi)完成。32 Bradford法1、溶液的配制Bradford儲(chǔ)存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mg考馬斯亮藍(lán) G-250室溫下長(zhǎng)期保持穩(wěn)定Bradford工作液425mlMilliQ水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30mlBradford儲(chǔ)存液Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾，保存于室溫棕色瓶中，用前過(guò)濾2.1mg/ml BSA 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液10mg BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白10ml MilliQ 水分裝成10小管，-20 C冰箱保存。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定IDBSA蛋白質(zhì)Mil

15、liQ水Bradford Abs標(biāo)準(zhǔn)溶液（訕）（訕）工作液( ml)(A595)Blank 01001001001012.597.510.06562.597.510.0656259510.162659510.185237.592.510.22487.592.510.25434109010.2611109010.3020512.587.510.303412.587.510.30806158510.3218158510.3523717.582.510.351417.582.510.42368208010.4279208010.42343、未知蛋白濃度的測(cè)定步驟：（1 ）將未知蛋白溶液移至試管，補(bǔ)加

16、 MilliQ水至100訕。（2）加入 1ml Bradford 工作液，充分混勻。（3）3.2min 后測(cè) A595的 0D值。（4）根據(jù)測(cè)得的A595的OD值，及未知蛋白的稀釋倍數(shù)，即可算出未知蛋白 的濃度。33 考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法1、溶液的配制1）染色液配制 TOC o 1-5 h z 95 乙醇50ml85 磷酸100ml考馬斯亮藍(lán) G-250100mg用MilliQ 水稀釋定容至1000ml,濾紙過(guò)濾，保存于棕色瓶中，4C冰箱 備用。2） 300ug/ml 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 30mgID標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)MilliQ水ID標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)MilliQ水蛋白濃度溶液（

17、訕）（訕）ug/ml )101000030010000302509501530.2879509501530.288431009003030.49121009003030.494842008006030.78352008006030.790153007009031.07383007009031.0775640060012031.180440060012031.1831750050015031.266350050015031.2712860040018031.343460040018031.3497980020024031.4482MilliQ 水定容至 100ml2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定染色液 ABS

18、( ml)(A 595)800 20024031.450510 1000 030031.48021000 030031.4837注：充分混勻，室溫（20-25C）保溫 15min4、未知蛋白濃度的測(cè)定步驟：對(duì)照管x 2樣品管X 2待測(cè)樣品（訕）0500MilliQ水（訕）1000500染色液（ml）3.03.0樣品管中的蛋白可根據(jù)需要選擇稀釋倍數(shù)。充分混勻，室溫20-25 C保溫15min。測(cè)A95處的OD值 計(jì)算：蛋白濃度（ug/ml ）x樣品稀釋倍數(shù)查A蛋白濃度（ug/ml ）x樣品稀釋倍數(shù)測(cè)試樣品用量（ml）蛋白質(zhì)樣品提取、 裂解條件對(duì)蛋白質(zhì)譜的影響較大， 尤其是蛋白質(zhì)提取的緩 沖液性質(zhì)

19、是影響電泳圖譜的關(guān)鍵。 本章在前一章的基礎(chǔ)上， 重點(diǎn)優(yōu)化蛋白質(zhì)提取 緩沖液、樣品 裂解液、電泳條件等技術(shù)方案。1 材料與方法11 供試材料供試黃瓜品種為山東密刺。 將種子催芽后播在裝有草炭土： 蛭石為 1：2（體 積比）的營(yíng)養(yǎng)缽中，溫室中培養(yǎng)，待黃瓜長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)，取第二片真葉，稱取 后置于-80 C冰箱中待用。1. 2 SDS聚丙烯酰胺凝膠濃度的比較1D樣品的提取和SDS-PAG：樣品液氮研磨，按1/5的比例加提取液（pH6.8 的 0.0625M Tris-HCL, 0.5%SD$5%甘油，3%B -巰基乙醇和 10% TritonX-100 ） -4 C提取1h, 10000rpm -4

20、 C下離心20 min。取上清液，加4倍體積的丙酮溶 液，-20 C沉淀過(guò)夜，10000rpm-4 C下離心20 min,去除上清，沉淀冷凍干燥。 24mg蛋白干粉加1ml蛋白樣品處理液（2% SDS 5%巰基乙醇，10%甘油，0.02 % 溴酚藍(lán)， 0.125M pH8.0 Tris-HCL ） ,沸水浴 3-5 min ，冷卻后供點(diǎn)樣用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度分別為 7.5 %、10%、12%、15%，濃縮膠 濃度為 4%。具體配制參照下表 3-1。1. 3 雙向電泳中黃瓜葉片蛋白質(zhì)不同提取方法比較1.3.1三氯乙酸/丙酮法（TCA/acetone法）:取1g植物葉片，液氮冷凍研

21、磨，加 5ml含0.2%DTT和20%TCA勺冷丙酮溶液勻漿，放置于-20 C冰箱過(guò)夜。之后4C 下13000rpm離心30min,棄上清液，沉淀用含0.2%DTT的丙酮溶液清洗三次（每 次均放于-20 C冰箱沉淀1h）。最后沉淀凍干，放于-80 C冰箱待用。1.3.2 DTT/丙酮法：取1g植物葉片，液氮冷凍研磨，加 5ml含2%DTT勺水溶液勻 漿。之后4C下1000rpm離心30min,取上清液，棄沉淀。上清液加 4倍體積的 冷丙酮，放置于-20 C冰箱過(guò)夜。之后4C下13000rpm離心30min,沉淀用80% 丙酮溶液清洗三次（每次均放于-20 C冰箱沉淀1h）。最后沉淀凍干，放于-

22、80 C 冰箱待用。1.3.3酚提取法：取1g植物葉片，液氮冷凍研磨，加 3ml提取液（1%PVPP,0.7M 蔗糖,0.1M KCL,0.5M pH7.5 Tris-HCL,500mM EDTA,1Mm PMSF,2%p -巰基乙醇）, 4C下1000rpm離心30min,取上清液加等體積的Tris酚，4C下放置30min,之 后10000 rpm離心15min,取酚相上清液。此過(guò)程反復(fù)提取 2-3次。最后酚相用 5體積0.1M冷乙酸銨溶液-20 C沉淀過(guò)夜。之后13000 rpm離心30min,沉淀用 0.1M冷乙酸銨溶液清洗三次，再用冷丙酮洗一次，最后沉淀凍干，放于-80 C冰 箱待用。

23、134 三氯乙酸/丙酮法/酚（TCA/acetone/phenol ）提取法：取1g植物葉片， 液氮冷凍研磨,加4ml冷丙酮,4 C下13000rpm離心3min,再用冷丙酮洗兩次 并離心。沉淀轉(zhuǎn)入研缽中，室溫干燥20min。干粉末重新研得更細(xì)，并轉(zhuǎn)到新管 中，得到得組織粉末用10%冷 TCA/丙酮溶液清洗3-4次，直到上清液無(wú)顏色為止。 最后用80%冷丙酮洗兩次，每次沉淀徹底重新旋棄，并離心。取0.050.1g干粉末在2.0ml管里重新懸浮于 0.8mlTris 酚和0.8mlSDS溶 液（含30%蔗糖,2%SDS,0.1M Tris-HCL Ph8.0, 5% B -巰基乙醇）中。該混合物

24、徹 底渦旋30S, 4 C下13000rpm離心30min,酚相移到新管中，用5體積0.1M冷 乙酸銨溶液-20 C沉淀過(guò)夜。之后13000 rpm離心30min,沉淀用0.1M冷乙酸銨 溶液清洗兩次，再用80%冷丙酮洗兩次，最后沉淀凍干，放于-80 C冰箱待用。表3-1SDS分離膠和濃縮膠的配置Table 3-1 Formulations for SDSSeparating and Stacking GelsSeparating Gel(0.375M Tris,pH8.8)Stacking Gel(1.25M Tris,pH6.8)Monomer Concentration(%T,2.67%

25、 C)7.5%10%12.5%15%4.0%Acrylamide/bis(30%T,2.67%C Stock)25.0ml33ml41.625ml50.0ml1.3mlDistilled water48.5ml40ml31.875ml23.5ml6.1ml1.5M Tris-HCl,pH8.825.0ml25ml25.0ml25.0ml-0.5M Tris-HCl,pH6.82.5ml10%(W/V)SDS1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml100110% ammonium persulfate(fresh)500訕5001500 1500 150 1TEMED50 til50 150 1

26、50 110 1TOTAL MONOMER100ml100ml100ml100ml10ml第一向IEF采取IEF方法（II） 0第二向SDS-PAG電泳分離膠濃度為15%, 電泳條件為20V/gel 20min,80V/gel 2h 。G-250膠體考染法染色。1. 4不同裂解緩沖液的比較Buffer 13g5M Urea3g2M thiourea1.52g100mM DTT146.4mg0.4% CHAPS40mg0.25% SB3-1025mgCarrier ampholyte25訕（40%）Bromophenol blue20訕(1%)0.25% Tween 2025訕10% Isopr

27、opanol1.0ml12.5% Saturated isobutanol1.25ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 28M Urea4.8g2M thiourea1.52g100mM DTT146.4mg0.4% CHAPS40mg0.25% SB3-1025mgCarrier ampholyte25訕(40%)Bromophenol blue20訕(1%)0.25% Tween 2025訕10% Isopropanol1.0ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 35M Urea3g2M thiourea1

28、.52g20mM DTT30.8mg2mM TBP100訕2% CHAPS0.2g2% SB3-100.2g0.5% Carrier ampholyte125訕(40%)Bromophenol blue20訕(1%)0.25% Tween 2025訕10% Isopropanol1.0ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 49.5M Urea5.7g2M thiourea1% 2M thiourea1% DTT2mM TBP4% CHAPS0.2% Carrier ampholyte Bromophenol blue 0.25% Tween 20 10% Glycerol 10mM PMSF 加 MilliQ 水至Buffer 57M Urea2M thiourea20mM DTT2mM TBP4% CHAPS1% ASB-140.5% T