WesternBlot實戰(zhàn)指引：從電泳到定量

1、【轉(zhuǎn)】Western Blot實戰(zhàn)指南：從電泳到定量-1樣品制備：變性條件SDS LB直接裂解：用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容 易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會改變）的1*SDS LB （或者略高1.5*）直接加到細胞 或者組織上并煮樣。通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積 比類推。通常條件下，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀 釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)現(xiàn)tip吸 不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時候常規(guī)做法有兩種，1.再 煮5min。常規(guī)煮樣時間3-5mi

2、n，樣品過濃時就煮10min； 2.如果10min煮樣后， 仍然吸不起來，才適當增加SDS LB，繼續(xù)煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時 間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續(xù)WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現(xiàn) 明顯的蛋白沉淀和水分層）此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做出，需要特殊方法，因此，這種 制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細胞器分離等等了，其實類似） 裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl

3、2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors （20g/ml leupeptin, 10pg/mi pepstatin A and 10 pg/ml aprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復雜也很貴，其實用0.5mM PMSF替代這三種就好了；如果還要 做磷酸化蛋白，加 1mM Na3VO4 （現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GPo此方法的優(yōu)點：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細胞的方式較為溫和，便 于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M （生理 鹽

4、濃度）、0.3M、0.6M （高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉淀 非常粘稠）及0.8-1.2M; 0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白， 尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用極端 的高鹽裂解細胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40,用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%,但此 時染色體會析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是.低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。.錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙）， 進一

5、步破碎；反復多次。.用上述細胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，收集上清液用于WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時對細胞生長條件的影響最小，是最 佳的實驗條件；但是這存在隱憂。因為含血清的培養(yǎng)基中含有非常豐富的BSA （牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在60-46 kDa之間的時候;用“任何” 抗體去檢測這一區(qū)間的蛋白，會有一片非常強的信號。因為此區(qū)間蛋白（主要是 BSA）濃度過于富集，會非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識別。同理， 采用SDS LB

6、裂解細胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng) 基中的BSA。采用無血清培養(yǎng)基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號 途徑，諸如AKT等），還會出現(xiàn)的問題是：.即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。.選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失, 尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重新溶解時，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索 充分溶解的條件，相對麻煩。實際上，如果你不是非常強調(diào)蛋白的分泌有什么

7、生理功能，一般不建議檢測上清， 尤其半定量的WB實驗檢測不同樣品間的差異。這里面有實驗操作細節(jié)的麻煩 經(jīng)驗之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但 90%的數(shù)據(jù)是cell乎出；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為 進一步分析做準備。樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長期；例外，IP用 樣品應(yīng)直接進行IP,避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過的 樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS 4度就會沉淀，何況-80度。上樣 前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也 會出現(xiàn)類似

8、拖尾；上樣過大也會）。在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意 定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細微的差別經(jīng)常忽略不計。細胞樣品可 以先計數(shù)再接種，短時間內(nèi)即使細胞生長有差異也不會對WB結(jié)果影響太多。組 織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作 過程也盡量避免蛋白損失。有人會說可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白 定量的不科學性，以及裂解液成分對定量的干擾。蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經(jīng)驗之談，8%膠最底邊 約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑 300KD

9、a-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%， 180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒 有嘗試過）。電泳一般采用恒流，45mA-55mA （應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當調(diào)整，要注意儀器最高 限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點，保證最 快速度完成電泳（電壓會逐漸增大），省時且減少擴散；但是由于電泳速度過快時會發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項：.聚丙烯酰胺的30%母液會降解，要4度避光保存。. APS會失效，10%APS 一般保質(zhì)期才一個月左右。-20度分裝

10、長期保存。.注意Tris buff的PH值，以及平時所用的水的PH值。PH值改變會使帶型非 常怪異，所有蛋白和澳酚藍壓成一條細線（即便在分離膠中），如果澳酚藍前有 紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從澳酚藍一直延伸到膠底部（澳酚藍此時涌動 極緩慢，位于膠中上部）.上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝 置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。SDS膠可能局部自溶，條帶 扭曲、變形。.配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平 滑，但是一些細微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩）， 其壞處是，在該部位極易導致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該

11、處或電泳散熱不好，條 帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會導致局部巨大氣泡，非常難于清 除；蛋白膠也會導致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒洗凈的另一個壞處是，由中學物 理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢,未洗凈的玻板會削弱和膠體間的粘附力， 拔梳子或邊條時會產(chǎn)生微小的錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間， 這個關(guān)系不大）；嚴重的錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或 者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時的錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水 更好，有SDS潤滑）。判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。.上樣時，不要把tip深入膠孔過

12、深（或者采用細的尖端拉長的專用上樣槍頭）， 可能會錯開膠和玻板，樣品會泄露。.未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會拉寬變形。通常 20ul 樣品（含 5ul 4*SDS LB）,可用 8-8.5ul 4*SDS LB 平衡。同理，點 marker 的 lane也要加入同樣體積的LBOLB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會有差異， 在新舊LB靠近的地方，條帶會拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填 空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。.增加上樣量不一定會提高熒光信號強度。增加上樣量的后果通常只能是讓你 的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因為增加上樣量最多只能提高幾

13、倍， 而WB靈敏度是以10的幾次冪量級的，所有目的蛋白信號的唯一方案就是IP富 集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣 量的另一個壞處是，本來高表達的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出 現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以6孔板80%以上匯合度為例，細胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul （最 少80ul,這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時的損失就太大，上樣就 很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時上樣量要控制在5-6ul, 最少2.5ul,最多10ul,10ul時內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋； 當然并

14、非不可以多上樣，再多對WB結(jié)果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶 都很丑。.不同樣品上樣時，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一 組細胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul,剛好+5川4*SDS LB達到常規(guī)20ul上樣體積;后者第8點提到只上5ul,同樣+5ul SDS LB （比重同，不會互相擠壓）, 最好補加10ul DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用 “空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul 4*SDS LB），這樣才能 確保每條帶都很美觀。. SDS PAGE膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊 邊條后的間

15、隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長期4度保存。個 人習慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。 兩種方案都可以。所以如果預計次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。 樣品是否一定需要定量再上樣？ 不是的，這是浪費時間的一個操作。我們首先來討論一下蛋白定量的科學性。蛋白定量首先需要一個參照系（標準蛋白），參照蛋白通常選擇8$人，也就是說 你所謂的定量是對應(yīng)于BSA的濃度的一個參照值。這里面存在一個問題，即忽 略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構(gòu)象還會影 響顏料分子的嵌入。因此你其實默認將所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊

16、狀態(tài)、光吸收情況下,然后做出的一個相對判斷，這就存在一個“系統(tǒng)誤差” 還不算上測量誤差等等，就已經(jīng)很不準確了。其次，裂解組織或細胞的時候,那些裂解液中，某些溶劑本身會使Coomassie G250 或者Bradford法（實際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如 NP40，就會使Coomassie顯藍色，可以完全覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的 藍色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂的蛋白定量實際是NP40 顏色和蛋白染色的疊加，根本不會符合標準蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準?！拘枰f明：我目前只知道NP40會這樣，因為我們從來不去定量，沒有做過更深入的研

17、究?！?實際上保證你的內(nèi)參一致，是從樣品制備開始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如 果你從制備樣品時就注意過定量問題，實際上通常內(nèi)參差別不會太大。如果真的 有差別，通常我們會先跑少量的樣品，目的是讓Actin或tubulin更清晰、不會粘 連、不會過曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，根據(jù)第一輪的內(nèi)參的熒光信號做 微調(diào)，大致能做到相當；最多可能需要第三輪。以上的試驗可以精確到0.1ul差 異（我很多體外生化試驗之前的調(diào)整酶量就是這樣進行，此時根本不可能有足夠 的蛋白讓你去定量）。當然憑曝光強弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn) 定，很可靠，這是需要相當多的經(jīng)驗積累，如果你一時掌握不了，可以讓經(jīng)驗更

18、豐富的師兄師姐或者導師幫忙。順便提到，有人問過用Quantity One等定量軟件對光密度定量后計算差別從而調(diào) 整上樣體積是否可以？ 不可以。因為WB結(jié)果經(jīng)過多重放大，精確計量只 代表相對于對照組的相對比值，與實際比值還是有誤差，所以按計算值更改上樣 量仍會出現(xiàn)偏差。如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中 嘗試一下，避免那些本身會顯色的物質(zhì)出現(xiàn)在你的裂解液中；當然，某些物質(zhì)的 去除可能影響對組織蛋白的提取。所以這是一個兩難的問題。轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果的影響并不如書本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚的那么大！ 首先必須澄清的是，很多時候新手會把WB結(jié)果無信號歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實

19、際上轉(zhuǎn)膜效率對最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識 別能力的強弱，以及如何正確使用抗體，這個問題下節(jié)討論。有一個簡單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預染的marker深淺可知），但對多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測沒有任何影 響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒有 很好的策略可以解決這個新濾紙的問題；嘗試過浸泡（會泡爛的）、預電泳（會 稍微好點）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。 每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流;水流太大，紙張會爛掉的）， 晾干再用；只要沒沖爛可以一直

20、反復使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對較長，所以每個步 驟的疊加作用會被級數(shù)放大，因此在試驗的每個步驟我們?nèi)詴η蟾茫虼艘?下仍會深入探討如何提高轉(zhuǎn)膜效率。針對提高轉(zhuǎn)膜的效率，個人認為最先應(yīng)該考慮到的是儀器的選用。這里不是歧視“made in China”，國內(nèi)的廠家很少注重不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì), 走低端策略，對于電泳儀這種技術(shù)含量不高的儀器倒可以湊合；但說到轉(zhuǎn)膜儀， 能把一個簡單的勻場電極做好的還真不多（就我道聽途說的，國外廠家為了使電 極之間場強更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過極薄的白金層）；因此轉(zhuǎn)膜效 率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個人使用過的國產(chǎn)

21、電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯 Tanon仿Biorad的還可以（算替它們免費打個廣告吧，Tanon仿biorad mini3型 電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認為“中國 制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進口，用過Biorad、amersham 和英國公司的scieplasoPS:批評一下Biorado Biorad的半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會莫名其妙的碎裂（絕 非摔裂、磕碰，因為底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除殘留鹽漬，基本不 會移動；即便如此它自然就會碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則

22、無法接通，導 致儀器報廢我們先后買過3臺都是這樣的毛病，其間間隔了 3年，不能肯定 近來Biorad有沒有改進這個問題；如果沒有，我想市場遲早會被其他公司所取 代）對這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，容易過早報廢；amersham 獨特的蜂窩式設(shè)計確實對轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸 面減少，電轉(zhuǎn)時散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確 實不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時仍可采用）長時程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在 4度冰柜或cold room進行；英國的產(chǎn)品，價格較高，公司不太出名國內(nèi)不一定 有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)。

23、這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn) 膜效率最佳，但靡費試劑、溶液，對普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時間長于半 干轉(zhuǎn)（下文會具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時、省試劑。 蛋白分子大小如何界定呢？習慣上認為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋 白，當然這只是一個相對標準。因此，通常對大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會選擇長時程 的濕轉(zhuǎn)，那么剛才提到的amersham半干轉(zhuǎn)儀的缺陷實際上沒太多實質(zhì)意義，何 況還可以外加條件彌補；而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來就是高手在懸崖上跳舞， 此時轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒有任何意義我說過轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果不起 決定因素。濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請參考分子

24、克隆，有必要指出的是，實際上用半干轉(zhuǎn)緩 沖液進行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復使用多次（=5次常規(guī) 1hr電轉(zhuǎn)，如有3hrs長時程轉(zhuǎn)染，緩沖液使用次數(shù)會減少），不過要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質(zhì)剩余不多，為確保轉(zhuǎn)膜溫度, 可開始或中途更換新鮮轉(zhuǎn)膜液）。電轉(zhuǎn)液中SDS增加蛋白的水溶性，促進蛋白 在電轉(zhuǎn)液中泳動。若不加5口5，蛋白會沉淀在膠上，但SDS過多會影響蛋白與 膜的吸附。甲醇能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但 高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的 濃度為20%，但PVDF膜截留marker上交

25、聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮 提升甲醇的濃度至25%（它對普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋 白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外SDS必須添加。甲醇的另一個作用是降溫， 舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度 升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點對半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因 為半干轉(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置的時間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴重，可臨時 少量補加。濕轉(zhuǎn)一般采用穩(wěn)壓，電壓控制在120-140V，時長1-3hrs（小蛋白控制在1hr，大 蛋白3hrs），有人會選擇60V過夜，從實驗的效率來講太浪費時間，對轉(zhuǎn)膜到底 有多大程度的增益難說，不太推

26、薦；半干轉(zhuǎn)一般穩(wěn)流，依m(xù)illipore PVDF膜附帶 說明書，當2.5-3mA/cm2,電壓25V（biorad半干儀額定值不能超過25V； amersham 半干轉(zhuǎn)儀，限壓30V。通常跑不到這么大的電壓，除非是新的濾紙或很久的轉(zhuǎn)膜 液，或常溫放置的轉(zhuǎn)膜液，或超大的膠），時間一般15-45min （常規(guī)用0.5hr）； 如果是3mA/cm2,時間不要超過0.5hr。這兩款儀器的限壓要求，可能出于保護 儀器的目的；amersham為防止過載，當電壓30V,35V附近的時候，保險會 自動跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V （因此足見其散熱性能

27、的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時間的 要求是針對PVDF膜的，這里面有一個很有趣的問題。盡管廠家一再表明PVDF 膜比NC膜對蛋白的截留更高（但NC帶負電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高， 所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對小分 子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預染marker上的顏料小分子很容易穿過 PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮 增加marker的上樣量）；NC膜沒有這種問題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時間也是小蛋 白1hr、大蛋白3hrs，電流控制在200-300mA（16cm*9cm大膠300皿，如果膠面 積小很多可以

28、考慮降低，實際上相當于2.5-3mA/cm2左右）ONC膜唯一不如PVDF 膜的地方，在我看來是它的強度：干燥的膜易碎。當然目前某些廠家為解決這個 問題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強度和PVDF膜類似， 但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時候要 特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也 不是一定必須。對于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本建議采用低濃度膠，如6% SDS。但實際操作 發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在 45KDa附近，而6%膠底邊澳酚藍指示60KDa左右，除

29、非采用壇子上有人提過的 灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個人 經(jīng)驗認為300KDa以下8%膠（底邊36e3）都可以勝任,可以適當調(diào)整選擇7-8% 膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。轉(zhuǎn)膜最好在低溫進行（高溫會局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒 有具體要求，但用預冷過的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條 件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前 -20度預冷，時間不能長于2比$，否則電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽的，冰槽 置-80度預冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治的過程中，書中強調(diào)過濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒有 膠、膜隔開

30、部分的濾紙會因為直接接觸而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓） 流，造成升溫過快。但進口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新 濾紙，消耗過快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實際 上濾紙大一些也不太要緊，但是我會選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙； 通常膜的大小會嚴格控制在與膠面積一致或略小一點點。操作時在保證每一層均 無氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個來回，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會 被拉伸，條帶會扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加 的時候每一層都無任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時可以一張張的疊加），更重 要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢?/p>

31、理解的是，對于蛋白分子的大小而言，膠 和膜之間的間距是數(shù)十萬倍計的，因此更緊密的接觸無疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少公司實驗講座時提出泡膠、泡膜，實際操作中沒有發(fā) 現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可 以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾 些緩沖液會有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤再投入緩沖液；NC直接進緩沖液）。如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來發(fā)現(xiàn)此操作不 僅增加額外的操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。首先，立春紅（也 包括考染膠）的靈敏度和HR

32、P-ECL體系的靈敏度相差太遠，即使立春紅染膜無 顏色，也無法提示W(wǎng)B結(jié)果會不會失?。既灸z無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了， 除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反耙蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示 靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立 春紅染膜失敗或成功，你都必須進行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的 操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不 采用更直觀的預染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時轉(zhuǎn)膜、顏色是交 聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會增 加任何額外的操作（固定marker的上樣量

33、非常必要）。當然上面提到針對PVDF 膜，由于對小分子截留的局限，顏料分子會在高強度的轉(zhuǎn)印過程中從交聯(lián)的蛋白 上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個lane糊掉；太緊（多）可改變 蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)， 這意味著在某些條件下，顏料會從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因為膜分子孔徑以及膜 對不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背面，而蛋白則被 牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過度的假象?，F(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換 NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細節(jié)，就可從根 本上忽略掉其對轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預染的marker僅

34、僅作為一個分子量大小的指針，當然同時可確認之前的轉(zhuǎn)膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可 為后續(xù)抗體孵育操作時膜的正反面做必要的提示。不同公司預染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預 染 marker 要上 8-10ul, MBI 的只要 5ul （膠大小 20X30cm）, Bioradmini3 型（8.2X7.4cm）MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰?？贵w孵育一WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個脾氣。對WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。無論 你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異

35、，而抗體的效 價可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價不被過分的拮抗, 謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。封閉最短可以縮減到5min:很多人把高背景或者黑板，認定為封閉不充分，其實這也是沒有吃透WB （說實 話，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無語）；實際上封閉（極端點） 也是個可有可無的步驟，真正對降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。 當你的抗體使用次數(shù)較多時，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新, 其實封閉最短可以縮減到5min （沒試過更短的，不一定不可以）。那什么導致 高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問題 （

36、增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可 以不同；通常封閉液是最簡單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復方。 封閉很少出狀況。不過在milk做封閉劑的封閉液中，milk顆粒未完全溶解時，微小的顆粒會粘附在膜上增加星點狀背景。緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗的關(guān)鍵首要 在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價和背景的強弱，然而歷來商品化的抗體質(zhì)量 參差不齊。各家生產(chǎn)的抗體中質(zhì)量問題最嚴重的是scbt的抗體，但它們的價格 卻是最便宜的。其實，scbt在美國的售后服務(wù)還是相當不錯的，只要按他們的要 求操作仍然能舉證抗體的質(zhì)量問題，可以更換、交換（你指定的他們銷售的另外 一種抗體），有時候還會附送一些ProA beads之類的，所以不奇怪它的普及率； 也正因為此，如果你參考文獻的話很容易找到這家公司的?？上?，在國內(nèi)