人胰島素的工業(yè)制備

1、 人工胰島素制備工藝的研究及其進展摘要:據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界糖尿病患者已接近1.2億，而我國目前糖尿病患者的總數(shù)已達到3000萬人，躍居世界第二位，其中數(shù)百萬患者長期使用胰島素治療。如今我國經(jīng)濟發(fā)展迅速，同時也帶來了巨大生活的壓力和健康問題，并且?guī)в幸欢ǖ倪z傳因素，數(shù)百萬患者需要長期使用胰島素治療。胰島素是由胰島B細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。而目前臨床使用的胰島素有三種來源：1、動物胰島素（從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體）。2、半合成胰島素（將豬

2、胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素）。3、重組人工胰島素（利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同）?？梢姷谌N方法是目前最好的副作用最小，而且簡單安全的方法。所以針對重組人工胰島素的制備做了以下研究。關(guān)鍵詞：重組人工胰島素；大腸桿菌；（His）6ArgArg一人胰島素原；在當今世界范圍內(nèi)，諾和諾德、輝瑞、萬安特以及我們國內(nèi)的通化東寶、深圳科興等生物技術(shù)公司在胰島素的生產(chǎn)技術(shù)上已經(jīng)都是很先進的水平了，也就是重組人工胰島素的制備方法。這種方法是自從動物中提取胰島素和人工合成胰島素的方法以來，最簡便而

3、且是最有效最安全的制備胰島素的方法。它是發(fā)酵工程技術(shù)和基因工程技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，也是造福人類的新一代藥物生產(chǎn)方法。不僅在治療糖尿病方面的作用突出，同時對治療癌癥等嚴重影響人類健康的疾病的治療開創(chuàng)了思路。所以，作為本科生的生物技術(shù)專業(yè)制藥方向的大學(xué)生來說，這種利用基因工程，發(fā)酵工程等方法工業(yè)制備胰島素的原理和流程的工藝，和這種開拓創(chuàng)新的思維是我們必須要了解和學(xué)習得。1重組人工胰島素的生產(chǎn)原理通過基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)hPI，經(jīng)后加工形成hi。酵母系統(tǒng)下游后加工比細菌表達系統(tǒng)簡單，但缺點是生產(chǎn)慢，生產(chǎn)周期長，且重組蛋白分泌量少（150mg/L），產(chǎn)量低。因此，雖然rhi投放市場已久，但人們一直在努力

4、尋求和探索更加有效的表達系統(tǒng)和高效的表達策略I2J，尤其是對E.CO尻表達系統(tǒng)的研究更是越來越深入，用E.coli系統(tǒng)表達hPI的策略也越來越多。另一方面，在胰島素的基因工程生產(chǎn)中，下游處理非常復(fù)雜，復(fù)雜的下游處理極大地降低了胰島素的最終收率。本研究圍繞著提高重組目的蛋白表達量，簡化下游處理過程等方面進行探索，建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的高效完整的基因工程E.coli發(fā)酵表達(His)6ArgArg一人胰島素原(His)6ArgArghumanproinsulin,PPhPI,后加工成hl的制備工藝。2重組人工胰島素的生產(chǎn)工藝流程菌種的制備目的基因的提取既從人的DNA中提取胰島素基因，可使用限制性內(nèi)切

5、酶將目的基因從原DNA中分離。主要有如下4種方法：(1)鳥槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對附近基因進行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針(2)人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒有內(nèi)含子。(3)從基因文庫中提?。阂簿褪鞘孪纫呀?jīng)提取完畢的拿來用PCR擴增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運作。提取質(zhì)粒使用細胞工程,培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細胞質(zhì)中提取質(zhì)粒質(zhì)粒為環(huán)狀。堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析?；蛑亟M將取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒

6、切開，再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”，形成一個能表達出胰島素的DNA質(zhì)粒。將質(zhì)粒送回大腸桿菌再大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì)，如CaCl2,這使細胞會吸收外源基因，此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會將重組質(zhì)粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進入受體細胞，此時的細胞處于感受態(tài)(理化方法誘導(dǎo)細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài))。胰島素的產(chǎn)生和精制(即菌種的發(fā)酵培養(yǎng))重組人工胰島素的工業(yè)生產(chǎn)制備和深加工技術(shù)在如今已經(jīng)是爐火純青。有近百年的發(fā)酵工程為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)在的基因工程技術(shù)的產(chǎn)物，在菌種制備后的發(fā)酵

7、培養(yǎng)過程更是可靠和安全的。發(fā)酵培養(yǎng)流程見下圖表：菌種擴培對從菌種庫中取出的菌種進行活化及初步擴大培養(yǎng)菌種擴培對從菌種庫中取出的菌種進行活化及初步擴大培養(yǎng)在種子罐中對菌種進行進一步的擴大培養(yǎng)，至菌種到對數(shù)生長期時轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)分兩階段進行控制，第一階段主要通過控制溶氧和補加甘油使菌體達到富集的目的，第二階段通過補加甲醇使菌體進行高密度表達目的產(chǎn)物，HPLC檢測目的產(chǎn)物含量目的產(chǎn)物存在于發(fā)酵液上清中，此步驟主要控制目的產(chǎn)物收率通過兩步柱層析，分別去除發(fā)酵上清液中的色素和雜蛋白利用紫外檢測儀控制目的產(chǎn)物收率，主要試劑為乙醇與異丙醇調(diào)節(jié)PH值，使P1沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體I固體控溫進行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，

8、主要試劑為DMSO與1,4-丁二醇再通過柱層析進行提純，主要試劑為異丙醇調(diào)節(jié)PH值，使P2沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體II固體通過控制濕度與溫度進行脫帽反應(yīng)，得到終產(chǎn)物胰島素主要試劑為丙酮，產(chǎn)品為半固體經(jīng)過兩步柱層析對胰島素進行提純，試劑為Tris-HCl和異丙醇通過超濾對提純后的胰島素進行濃縮，通過管道傳遞到下工序通過制備色譜對胰島素粗品進行精制，主要試劑為色譜乙腈然后經(jīng)兩步結(jié)晶后通過管道過濾除菌到百級區(qū)對胰島素成品進行一次結(jié)晶和水洗對水洗后的胰島素進行過濾除菌后凍干，即得胰島素成品制得的胰島素經(jīng)過深加工，可以得到片劑，注射劑和肺部吸入制劑等。3藥物檢測這種重組人工胰島素的檢測重點應(yīng)該是測定

9、生物活性效價測定控制產(chǎn)品中雜質(zhì)潛在有害物質(zhì)保證產(chǎn)品安全性和有效性胰島素的生物效應(yīng)包括許多方面,它是體內(nèi)唯一能降低血糖的激素。也是唯一時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。胰島素的主要靶器官為肝臟、肌肉及脂肪組織,它控制著三大營養(yǎng)物質(zhì)糖、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝和貯存。最明顯的作用是影響糖的代謝,降低血糖,即促進肝臟及肌肉組織中葡萄糖的利用,激活糖原合成酶和丙酮酸脫氫酶等的活性,促進糖原的合成并抑制糖原的分解。此外,對肝臟來說還有抑制蛋白質(zhì)分解的作用;在肌肉組織中促進+K從細胞外向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運；在脂肪組織中促進氨基酸由細胞外向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,促進脂肪的合成,抑制脂肪的分解等作用。這些在細胞水平上對代謝系統(tǒng)的

10、作用是基于胰島素與其受體的結(jié)合得以實現(xiàn)的。關(guān)于效價的測定中華人民共和國藥典指出供試品制成鹽酸溶液，進入高效液相色譜儀進行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于波長214nm處檢測重組人胰島素的吸收值，計算出其含量。無數(shù)臨床試驗證明，到目前為止，重組人工胰島素是穩(wěn)定糖尿病最好的選擇，其沒有潛在的危險，并且安全可靠。4問題與展望胰島素在糖尿病治療中具有無可替代的作用和地位，但因注射給藥讓許多患者產(chǎn)生畏懼心理，使其作用發(fā)揮受到限制。為了減少不便和疼痛，醫(yī)藥界正在全力以赴投入研究，開發(fā)更新的胰島素劑型及給藥方式。目前有關(guān)新式胰島素產(chǎn)品的研究方向，可歸納為3類:.新的給藥方式，例如:口服、吸入;.改變藥物代謝機

11、制;.改進注射手段，讓使用者無痛;這是國際國內(nèi)胰島素類藥物研究發(fā)展的前沿和趨勢。4.1非注射型胰島素讓胰島素和其他藥物一樣成為非注射型藥品，通過口服、鼻吸等途徑進入人體而免除注射，需要研究解決制劑吸收的問題。由于胰島素本身的療效和安全性已經(jīng)非常確定，而改變的是給藥途徑，因此吸收程度和速度是需要解決的首要問題。4.2口服胰島素胰島素本身為蛋白質(zhì)，口服后會被胃腸道降解破壞，所以常規(guī)胰島素不能口服。口服給藥受到胃酸、蛋白分解酶、大分子吸收、肝臟首過效應(yīng)等影響，因此，口服胰島素的研究方向主要在以下幾方面:.選用惰性材料如高分子纖維素，制成了微小包裹球。這種小球在胃中不溶，保護胰島素不被破壞?，F(xiàn)階段的研

12、究成果可保持其生物有效性達到皮下注射給藥的一半。.加入酶抑制劑，將蛋白酶抑制劑與胰島素一起包裹在小球中，可有助于提高胰島素的吸收。.加入吸收促進劑，將胰島素與吸收促進劑同時給藥，能進一步促進口服胰島素吸收，其中的螯合劑能與腸粘膜上活性離子結(jié)合，造成膜通道通透性增加而促進藥物在腸道吸收。國內(nèi)外有關(guān)口服胰島素研究報道雖然很多，但至今未見到實際應(yīng)用于臨床。其主要原因是口服生物利用度低、制劑的穩(wěn)定性、質(zhì)量標準等問題尚未解決?？诜葝u素的成功與否在于如何解決其在胃腸道的活性和穩(wěn)定性，一旦成功將是胰島素研究的重大突破。經(jīng)肺吸入胰島素胰島素經(jīng)肺吸入給藥，是替代注射最有希望的途徑之一。肺部特殊的生理構(gòu)造是具有

13、極大的肺泡表面積。此點優(yōu)勢具有決定性，使胰島素這樣的大分子藥物吸收成為可能;藥物可迅速到達;不必經(jīng)過肝臟首過效應(yīng);提高了藥物的生物利用度。另外重要的一點，胰島素在肺部吸收的速度快，符合內(nèi)源性胰島素的釋放特征和人體的需要，并且可以在進餐的同時應(yīng)用，而使用藥更加方便。最新的進展是采用干粉劑型，其優(yōu)于早先的液體氣霧劑。干粉的穩(wěn)定性好，保質(zhì)期可達兩年;干粉的載藥量高，僅需吸13次即可滿足劑量要求，而如果用噴霧則需深吸幾十次。胰島素吸入制劑在國外已進入第二、三期臨床試驗，一些制藥公司的專家相信在不久的將來就會投入使用。此項技術(shù)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，但其面臨尚待解決的問題是:藥物吸收的穩(wěn)定性、成本高以及對

14、肺功能的影響等，通過臨床試驗和上市的時間尚屬未知。吸入胰島素相對于傳統(tǒng)的注射方式的優(yōu)越性不言而喻，且理論上頗具可行性，我們的醫(yī)生和患者都在熱切盼望中。其他非注射給藥方式正在研究中的其他非注射胰島素給藥途徑包括:口腔噴霧、鼻腔給藥、直腸栓劑給藥、滴眼劑、透皮或口腔粘膜給藥。這些非注射給藥途徑都有一些難以克服的問題，如吸收緩慢、藥峰濃度低、生物利用度低等，均不能達到注射劑的效果，目前尚無法適合糖尿病臨床治療的需要。胰島素非注射給藥是醫(yī)藥界的重大和熱門研究課題，其結(jié)果對糖尿病治療產(chǎn)生深遠影響。國內(nèi)外的專家學(xué)者正致力于相關(guān)的研究開發(fā)。參考文獻:1李曉紅，朱慧玲，余榮，李紅霞.重組人工胰島素制備工藝M.四川大學(xué)學(xué)報，2007,39卷第4期.王瓊慶，馮