魚腥草蛋白酶抑制劑的分離和純化

1、魚腥草蛋白酶抑制劑的別離和純化【摘要】目的以魚腥草為材料，研究魚腥草蛋白酶抑制劑(HTI)的別離提取工藝。方法HTI的最正確粗提條件是采用pH7.0的雙蒸水為提取溶劑，在體積比為130，45條件下浸提2.0h，提取2次。硫酸銨局部沉淀后，再經(jīng)DEAE-52離子交換層析柱純化。結(jié)果粗提液經(jīng)4560飽和度的硫酸銨沉淀比活力最高，經(jīng)過DEAE-52離子交換層析柱梯度洗脫后，檢測到HTI活性峰。結(jié)論用DEAE-52離子交換層析柱可別離純化HTI，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，計算出該HTI的分子量約為28KDa?！娟P(guān)鍵詞】胰蛋白酶抑制劑；魚腥草；別離純化Abstrat：bjetiveTstudythei

2、slatinandpurifiatinpredurefTIfrHuttuyniardataThunb.ethdsTheptialriteriafTIextratinere45,30tiesfslventvlue,pH7.0and2h.ThebinatinfaniusulphatepreipitatinandDEAE-ellulselunhratgraphyasusedtpurifytheTI.ResultsThespeifiativitypeakfTIurredinthepartf45%60%(NH4)2S4preipitatin,andasnsequentlypurifiedbyDEAE-e

3、llulselungradientelutin,andtheativityfTIuldbedeteted.nlusinTheHTIanbepurifiedithDEAE-ellulselun,andtheleularEightfHTIisdeterinedbySDSas28KDa.Keyrds：Trypsininhibitr;HuttuyniardataThunb;Islatinandpurifiatin胰蛋白酶抑制劑(Trypsininhibitr,TI)除了在臨床上用來治療急性胰腺炎、肺氣腫、腦水腫和腦缺血外，目前還發(fā)現(xiàn)它在HIV和腫瘤的治療中也有重要意義1?；瘜W合成的TI生物利用度低、副

4、作用大以及產(chǎn)生耐藥性等缺點，植物來源的TI具有兼容性好、平安和特殊的藥物特性等優(yōu)點。因此，從傳統(tǒng)中藥中挑選具有TI有活性的材料有很廣闊的應用前景和市場價值。魚腥草為三白草科植物蕺菜HuttuyniardataThunb的地上局部，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之成效，是臨床應用極其廣泛的中藥之一。本文在前期研究的根底上，對魚腥草中TI進展了別離純化，獲得的結(jié)果對開發(fā)植物來源的TI具有重要意義。1材料與儀器1.1試劑胰蛋白酶(北京麒麟宏偉公司)，苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺(上海三杰生物技術(shù))，DEAE-纖維素(Siga)，三-羥甲基-氨基甲烷，無水氯化鈣，鹽酸，三氯乙酸，氫氧化鈉等為國產(chǎn)分析

5、純。1.2儀器可見光分光光度計，高速冰凍離心機，精細pH計，數(shù)顯恒溫水浴鍋，精細電子天平，蛋白質(zhì)電泳儀等。2方法2.1魚腥草胰蛋白酶抑制劑抑制率的測定參考杜旭東等2，3的苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺(BAPNA)法。2.2魚腥草胰蛋白酶抑制劑的別離與純化參考康莊等4的方法進展。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1硫酸銨分級沉淀按照硫酸銨沉淀表，對樣品浸提液添加硫酸銨至30，45，60，75飽和濃度，分別測定各濃度下的體積、抑制活性和蛋白濃度。pH值為6.0的樣品浸提液實驗結(jié)果見表1，pH值為8.0的樣品浸提液實驗結(jié)果見表2。表1pH6.0條件下硫酸銨分級沉淀TI的結(jié)果略表2pH8.0條件下硫酸銨

6、分級沉淀TI的結(jié)果略從圖1可以看出，兩種不同pH體系活性析出均集中于3075飽和度，但4560飽和度下比活力最高，且pH8.0體系時比活力大。因此，在以后的純化過程中，均采用pH8.0溶液體系對樣品液進展硫酸銨分級沉淀，加(NH4)2S4至40飽和度，以除去堿性或中性雜蛋白。再加(NH4)2S4至60飽和度，搜集沉淀，溶解透析供下步離子交換層析用。抑制劑的析出在pH6.0體系比pH8.0體系要早，這說明抑制劑可能是一種酸性蛋白。3.2DEAE-52離子交換別離純化取pH8.0Tris-Hl緩沖液透析后的粗提液5l，上DEAE-52離子交換柱(2.515),流速為0.75l/in，以50l緩沖液

7、洗脫,使樣品液壓實，再分別用由緩沖液配制的60400lNal溶液進展梯度洗脫，所得各管洗脫液(每管搜集3l)在紫外光280n下測其吸光度，檢測蛋白含量，其梯度洗脫曲線見圖2。由圖3可知,在5570號試管具有HTI活性，以6063號活性最高。搜集60號試管及附近活性較高的試管保存，進一步處理后進展HTI相對分子量的測定。洗脫液的濃度梯度與試管號的對應關(guān)系見表3。表3洗脫液的濃度梯度與試管號的對應關(guān)系略3.3魚腥草胰蛋白酶抑制劑的相對分子量的測定DEAE-52離子交換柱別離純化后HTI液的活性峰經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果如圖4。由電泳圖譜上測定的標準蛋白相對遷移率及其分子量，待測蛋白的遷移

8、率為0.530。經(jīng)計算機處理數(shù)據(jù)后，得回歸方程：LgY=1.355X+5.1653如圖5所示，將待測的蛋白相對遷移率帶入方程，計算出HTI的分子量約為28kDa。4討論本實驗在粗提過程中采用分級鹽析法除掉了局部雜蛋白，別離過程中用到了DEAE-52離子交換層析法，并檢測到活性峰。說明分級鹽析發(fā)揮了一定作用，從而簡化了別離純化過程，測得HTI分子量約為28kDa。為該胰蛋白酶抑制劑的進一步深化研究奠定了一定的理論基矗【參考文獻】1劉同祥,牛建昭,杜旭東,等.具有蛋白酶抑制劑活性成分中藥的挑選J.中國中藥雜志,2022,32(7):643.2杜旭東,劉同祥,張宗申,等.正交實驗法優(yōu)選魚腥草胰蛋白酶抑制劑的提取工藝J.時珍國醫(yī)國藥,2022,18(10):23