信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸分子基礎(chǔ)課件

1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸分子基礎(chǔ)1.堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶存在于DNA和RNA中僅存在于RNA中僅存在于DNA中一、核酸的組成與結(jié)構(gòu) (一）核苷酸嘌呤(purine，Pu) 腺嘌呤(adenine, A)鳥嘌呤(guanine, G)嘧啶(pyrimidine，Py)胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶(thymine, T)稀有堿基3.核苷嘌呤N-9 或嘧啶N-1與脫氧核糖C-1通過-N-糖苷鍵相連形成脫氧核苷(deoxyribonucleoside)。 嘌呤N-9或嘧啶N-1與核糖C-1通過-N-糖苷鍵相連形成核苷(ribonucleoside)

2、。NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷鍵核苷或脫氧核苷與磷酸通過酯鍵結(jié)合構(gòu)成核苷酸(ribonucleotide)或脫氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。4.核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO-HOO糖苷鍵酯鍵多磷酸核苷酸cAMP（二）環(huán)化核苷酸cGMPWatson-Crick模型Watson，James Dewey（詹姆斯沃森；1928 )弗朗西斯哈里康普頓克里克（Francis Harry Compton Crick 1916.6.82004.7.28）*Chargaff 規(guī)則研究背景獲得了高質(zhì)量的DNA

3、分子的X射線衍射照片。提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)(double helix)模型。a.富蘭克林 b.DNA的X線衍射圖片堿基互補配對三鏈結(jié)構(gòu)鳥嘌呤之間通過Hoogsteen氫鍵形成特殊的四鏈結(jié)構(gòu)(tetraplex)。四鏈結(jié)構(gòu)原核生物DNA多為環(huán)狀，以負(fù)超螺旋的形式存在，平均每200堿基就有一個超螺旋形成。核小體串珠樣的結(jié)構(gòu)核小體鏈和螺旋管1. 基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，存于細(xì)胞核，（除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因組是雙份的，即雙倍體,diploid）有兩份同源的基因組。 真核生物DNA特點2.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子； 即一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個mRNA分子和一條多肽鏈。3.存

4、在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達百萬次以上； 4. 基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域； 5.大部分基因含有內(nèi)含子，基因是不連續(xù)的；6.基因組遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，有許多復(fù)制起點 （四）RNA的結(jié)構(gòu)（1）tRNA（2）mRNAhnRNA 內(nèi)含子(intron)mRNA 外顯子(exon)（3）rRNA（1）樣品DNA或RNA的定量A260 = 1.0 相當(dāng)于 50g/ml 雙鏈DNA(dsDNA)40g/ml 單鏈DNA (ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸（2）確定樣品中核酸的純度 純 DNA: A260/A280 = 1.8純 RNA: A260/A280 = 2.0 核酸提取樣品：

5、 A260/A280=1.82.0比值大的純度不一定高，還可能是提取過程中有酚等其他有機物的干擾。紫外吸收的應(yīng)用2.核酸的變性、復(fù)性和雜交解鏈溫度(melting temperature，Tm)G+C 含量越高，解鏈溫度就越高。退火(annealing)與雜交DNA雜交的退火溫度Tm-25（二）核酸的提取、分離和純化1.DNA的提取分離（1）苯酚法（常用） 苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用。 可用玻璃慢慢繞成一團，取出。此法的特點：DNA保持天然狀態(tài) . (2) CTAB 法 加苯酚有效的去除蛋白質(zhì)，但是苯酚的氧化物對DNA有破壞作用，用過苯酚之后再用氯仿異戊醇抽提一次以除去

6、殘余的苯酚。(3)三氯甲烷法1.三氯甲烷-戊醇除蛋白（中間層）2.水相提取DNA3.三氯甲烷-戊醇再除蛋白4.水相再提取DNA（至無蛋白凝膠）(4)酶法蛋白酶除蛋白核酸酶除RNA提純DNA（1）Trizol法（異硫氰酸胍苯酚混合液相提取法） 異硫氰酸胍裂解細(xì)胞核蛋白體分離RNA釋放到水相2.RNA的提取分離（2）硅膠膜特異性吸附離心柱提取法 異硫氰酸胍裂解細(xì)胞抑制RNA酶RNA釋放硅膠特異性吸附RNA 除去蛋白質(zhì)和DNA 低鹽洗脫RNARNA分布三、核酸含量測定的原理（一）定磷法P：9.4%9.6%（二）定糖法1.核糖2.脫氧核糖（三）紫外吸收法（四）環(huán)核苷酸的檢測1.競爭性蛋白結(jié)合法測cAM

7、P（125IcAMP放免試劑盒 ） 2.放射性免疫法測細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度 第六節(jié) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂類分子基礎(chǔ) 脂肪酸 (fatty acids)脂肪(fat)甘油三酯(動物)油(植物源)類脂(lipids)磷脂固醇及其酯相關(guān)化合物脂類三酰甘油 甘油磷脂(phosphoglyceride)膽固醇酯 FA膽固醇 FAFAFA 甘油 FAFAPiX 甘油 X=膽堿、水、乙醇胺、絲氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等。一、脂類基本構(gòu)成： 分類含量 分布 生理功能脂肪三酰甘油 95脂肪組織、血漿1. 儲脂供能2. 提供必需脂酸3. 促脂溶性維生素吸收4. 熱墊作用5. 保護墊作用6. 構(gòu)成血漿脂蛋白類脂糖酯、膽固

8、醇及其酯、磷脂5生物膜、神經(jīng)、血漿1. 維持生物膜的結(jié)構(gòu)和功能2. 膽固醇可轉(zhuǎn)變成類固醇激素、維生素、膽汁酸等3. 構(gòu)成血漿脂蛋白脂類的分類、含量、分布及生理功能脂類的生理功能血漿脂蛋白 組成：蛋白質(zhì)、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯內(nèi)核： 甘油三酯 膽固醇酯中性脂類 CM VLDL LDL HDL密度0.950.951.0061.0061.0631.0631.210組成脂類含TG最多， 8090%含TG 5070%含膽固醇及其酯最多，4050%含脂類50%蛋白質(zhì)最少, 1%510%2025%最多，約50%載脂蛋白組成apoB48、E A、A A、C C、CapoB100、C、C C、 EapoB

9、100apo A、 A磷脂是指含磷酸的脂類二、磷脂甘油磷脂：由甘油構(gòu)成的磷酯（體內(nèi)含量最多）鞘磷脂：由鞘氨醇構(gòu)成的磷脂X指與磷酸羥基相連的取代基，包括膽堿、水、乙醇胺、絲氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等。FAFAPiX 甘油FA PiX 鞘氨醇相同的組成成份(分子數(shù))不同或不盡相同的組成成份磷酸脂酸醇類其他成分甘油磷脂12甘油膽堿、乙醇胺、絲氨酸、肌醇等鞘磷脂11鞘氨醇膽堿甘油磷脂與鞘磷脂的分子組成（一）甘油磷脂組成：甘油、脂酸、磷脂、含氮化合物結(jié)構(gòu)： 功能：含一個極性頭、兩條疏水尾，構(gòu)成生物膜的磷脂雙分子層。常為花生四烯酸 X = 膽堿、水、乙醇胺、 絲氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等 (cep

10、halin) (lecithin) 磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol) 磷脂酰絲氨酸 (phosphatidyl serine) 心磷脂 (cardiolipin)原料：脂酸、甘油 膽堿、絲氨酸、肌醇、磷酸鹽絲氨酸 乙醇胺 膽堿 CO2 3 SAM（S-腺苷甲硫氨酸）部位： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（二）甘油磷脂的合成1.甘油二酯合成途徑（卵磷脂、腦磷脂）2.CDP-甘油二酯合成途徑（心磷脂、磷脂酰肌醇）PLA1 PLA2PLCPLDPLB2PLB1磷脂酶 (phospholipase , PLA)（三）甘油磷脂的降解（四）鞘磷脂三、脂類第二信使及分析1.IP3的分離測定 取細(xì)胞溶解液水相2ml裝入Dowex l8 Formate型微型沉析柱(Sigma產(chǎn)品)，分別用15ml水、10ml四硼酸鈉/甲酸鈉(560mol/L)、6ml甲酸/甲酸銨(0.10.2mol/L)、10ml甲酸/甲酸銨(0.10.4mol/L)、7ml甲酸/甲酸銨(0.11.0mol/L)分別洗脫游離肌醇(FMI)、糖磷脂酰肌醇(GPI)、1-磷酸肌醇(IP)、2-磷酸肌醇(IP2)、3-磷酸肌醇(IP3），分步收集各段洗脫液，每管1ml，液閃測定各管放射活性，繪制洗脫曲線并測定每段的總放射活性。2.DAG測定 （1） 向培養(yǎng)的M中加入3H-甘油 （2） 置5% CO2 95%空氣孵箱中37孵育