實驗免疫學(xué)技術(shù)課件

1、應(yīng)用于免疫學(xué)的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于免疫學(xué)的其他分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)-免疫PCR流式細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免疫傳感器免疫磁珠技術(shù)動物模型第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記1. 特點：免疫學(xué)在分子水平發(fā)展的一門技術(shù)定性、定量檢測特異DNA或RNA序列片段第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記2. 原理： 具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是探針與待測核酸，雜交后形成的異質(zhì)雙鏈分子稱為雜交分子。由于雜交是在分子水平進行的，故稱為分子雜交。3. 探針：cDNA探針基因組探針寡核苷酸探針RNA探針第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記3. 探針：cDNA探針

2、基因組探針寡核苷酸探針人工合成根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出核酸序列RNA探針第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記3. 探針：RNA探針： 將目的基因克隆到Sp6或T7啟動子下游的MCS中，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游消化重組質(zhì)粒，使之線性化，加入Sp6或T7 RNA聚合酶、NTP和-32P-UTP，即可以目的基因的DNA為模板合成高放射性的RNA探針。第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記4. 標(biāo)記方法的選擇：體內(nèi)標(biāo)記法體外標(biāo)記法不需要活體生物或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)標(biāo)記前的分離和純化方便，可以用時再標(biāo)記，減少放射性核素污染體外標(biāo)記一般比體內(nèi)標(biāo)記的比放射活性高很多第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記DNA探針的酶促標(biāo)記法缺

3、口平移法隨機引物法PCR法末端標(biāo)記法第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記非放射性核素探針的Southern印跡雜交 地高辛標(biāo)記檢測試劑盒，此體系是將具有類固醇半抗原性質(zhì)的地高辛配基標(biāo)記的dUTP用隨機引物法摻入到探針DNA鏈上，然后與靶DNA上的同源序列進行雜交，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，在底物硝基藍四氮唑（NBT)和BCIP存在下，進行酶聯(lián)免疫顯色反應(yīng)，從而到達檢測目的。第一節(jié) 核酸分子雜交的探針標(biāo)記基因芯片實驗程序免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記,Southern 印跡雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-免疫PCR流式細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免疫傳感器免疫磁珠技術(shù)動物模型第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)PCR工作原

4、理簡單理解為2n級數(shù)擴增模板三步過程：變性、退火、鏈延伸PCR產(chǎn)物的檢測方法PCR類型一般PCR 檢測病原體基因反轉(zhuǎn)錄PCR定量PCR定量PCR半定量PCR實時PCR,又稱熒光定量PCR 常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運用熒光能量傳遞技術(shù)，加入熒光標(biāo)記探針，借助熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物。提高了靈敏度，還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，根據(jù)CT值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng) 熒光定量PCR技術(shù)： 是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。第二節(jié)

5、 聚合酶鏈反應(yīng)PCR的應(yīng)用舉例質(zhì)粒鑒定基因亞克隆第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)Fragments digested by EcpRI and Not IpGEX-CT703PCR product質(zhì)粒鑒定IM-PCR的幾種反應(yīng)方式：固相支持物抗原吸附特異性抗體生物素化抗抗體親合素生物素化DNA PCR固相支持物抗原吸附特異性抗體SPA生物素蛋白親合素生物素化DNA PCR固相支持物包被單克隆抗體抗原多克隆抗體生物素化抗抗體親合素生物素化DNA PCR第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)實驗舉例IM-PCR檢測NPY實驗材料： 親合素，生物素化dUTP，生物素化羊抗兔IgG，NPY標(biāo)準(zhǔn)品，NPY單克隆抗體、NPY多克隆抗體

6、、腺病毒六鄰體基因引物，3型腺病毒實驗方法：第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)雙抗體夾心IM-PCR：包被NPY單克隆抗體封閉加入不同稀釋度的NPY抗原加入NPY多克隆抗體加入生物素化羊抗兔IgG親合素生物素標(biāo)記的指示分子DNAPCR定性和定量分析NPYIM-PCR的應(yīng)用和發(fā)展IM-PCR目前尚處于研究階段，尚未有一個十分成熟和忙一的方法,配套試劑尚缺乏,所以應(yīng)用得尚不多。適用于檢測一些含量特別少的抗原分子；第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記,Southern 印跡雜交聚合酶鏈反應(yīng)-免疫PCR流式細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免疫傳感器免疫磁珠技術(shù)動物模型第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)是對單細(xì)胞進行定量分析

7、和分選的一種自動分析細(xì)胞的高新技術(shù)，被譽為實驗室的“CT”。流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是集現(xiàn)代電子物理技術(shù)、激光技術(shù)、電子計算機技術(shù)于一身的先進科學(xué)儀器流式細(xì)胞定量技術(shù)與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法相結(jié)合，進行細(xì)胞表面抗原、癌基因抗原、其他細(xì)胞內(nèi)抗原、細(xì)胞受體及其他成分檢測，彌補了傳統(tǒng)免疫學(xué)難以準(zhǔn)確定量的弊端，已初步形成一個獨特的學(xué)科分支流式免疫學(xué)熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescence activated cell sorter， FACS）流式細(xì)胞儀的特點： 單個細(xì)胞分析 同時多參數(shù)分析 速度快：10000個細(xì)胞/秒 統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況 分選感興趣的細(xì)

8、胞第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)工作原理：流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM,又名FACS）是一種 可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù) 將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能夠包饒著樣品高度流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。第三節(jié) 流

9、式細(xì)胞術(shù) 液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光集中系統(tǒng) 電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流式免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用：測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)流式免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用：細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞凋亡研究；定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時相的細(xì)胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系腫瘤學(xué)：DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標(biāo)。近年來已應(yīng)用DNA倍體測定技術(shù)，對白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細(xì)胞進行探測。第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)流式免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用：免疫學(xué)：研究細(xì)胞周期或D

10、NA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達的關(guān)系；進行免疫活性細(xì)胞的分型與純化；分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測等。血液學(xué)：血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等；用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血；檢測血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記,Southern 印跡雜交聚合酶鏈反應(yīng)-免疫PCR流式

11、細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免疫傳感器免疫磁珠技術(shù)動物模型Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過在一微小的基片表面固定大量的分子識別探針，或構(gòu)建微分析單元和系統(tǒng)，實現(xiàn)對化合物、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞或其它生物組分準(zhǔn)確、快速、大信息量的篩選或檢測。第四節(jié) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)生物芯片的主要類別:蛋白芯片基因芯片 芯片實驗室第四節(jié) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白芯片的原理1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上2. 抗體或抗抗體標(biāo)記示蹤酶：HRP、AKP膠體金熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等點抗原測抗體3.檢測標(biāo)本中的抗體或抗原點抗原測抗體3.檢測標(biāo)本中的抗

12、體或抗原點抗體測抗原3.檢測標(biāo)本中的抗體或抗原滲濾式蛋白芯片 反應(yīng)完畢后0.5小時內(nèi)，將晶片放入晶片放入晶片閱讀系統(tǒng)進行閱讀分析蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用：微生物感染病原體抗原、抗體的檢測自身抗體的檢測特定蛋白的檢測HLA分型過敏原檢測腫瘤標(biāo)志物的檢出第四節(jié) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記Southern 印跡雜交聚合酶鏈反應(yīng)-免疫PCR流式細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免疫磁珠技術(shù)免疫傳感器動物模型在幾分鐘內(nèi)可以從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離高純度細(xì)胞。細(xì)胞用 MACS 微型磁珠特異性標(biāo)記，這些細(xì)胞通過一個放在強而穩(wěn)定磁場中的分選柱。分選柱里的基質(zhì)造成一個高梯度磁場。被磁性標(biāo)記的細(xì)胞滯留在柱里而未

13、被標(biāo)記的細(xì)胞則流出。當(dāng)分選柱移出磁場后，滯留柱內(nèi)的磁性標(biāo)記細(xì)胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標(biāo)記和未標(biāo)記的兩個細(xì)胞組份。Label the cells of interest with MACS MicroBeads in a short incubation step.Pass the mixture of labeled and unlabeled cells over a separation column placed in the magnetic field of a MACS separator. Collect the flow through as the non-ma

14、gnetic fraction.Remove the separation column from the magnet and flush out the retained cells as the positively selected cells由于微型磁珠的體積極小，所以不會對細(xì)胞造成機械性壓力，而且使孵育時間短，操作過程快。MicroBeads 形成一個穩(wěn)定的膠體液，它們在磁場中既不沉淀又不凝聚。微型磁珠的大小和它的組成成份（氧化鐵和多糖）使其可被生物降解，且不會激活細(xì)胞或影響細(xì)胞的功能和活力，細(xì)胞的生理功能也不變。磁珠不需要去除，因此，陽性分選出的細(xì)胞（即磁性標(biāo)記細(xì)胞）可立即用于分

15、析和隨后的實驗。第五節(jié) 免疫磁珠技術(shù)用MACS 細(xì)胞分選系統(tǒng)可以分離出非常純的細(xì)胞群體，而且有極好的回收率和存活率。依據(jù)細(xì)胞頻率和標(biāo)記表達水平的不同，MACS分離細(xì)胞的純度可達95%-99.9%，回收率90%。CD4+ T helper cells isolated from PBMC using MACS, labeled with CD4-FITC.第五節(jié) 免疫磁珠技術(shù)CliniMACS是一個封閉、無菌的細(xì)胞分選系統(tǒng)，而autoMACS可用于高流量樣品的分選第五節(jié) 免疫磁珠技術(shù)免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記,Southern 印跡雜交聚合酶鏈反應(yīng)-免疫PCR流式細(xì)胞術(shù)蛋白質(zhì)芯片免

16、疫磁珠技術(shù)免疫傳感器動物模型生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)化器緊密結(jié)合,對特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。它是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進的檢測與監(jiān)控方法,也是對物質(zhì)在分子水平上進行快速和微量分析的方法免疫傳感器：利用抗體和抗原能相互識別和結(jié)合的功能而研制的一種生物傳感器。第六節(jié) 免疫傳感器（immunosensor） 2. 生物傳感器工作原理 生物傳感器的工作原理是待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?，再?jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測定其電流值或電壓值，

17、從而換算出被測物質(zhì)的量或濃度。 3 生物傳感器優(yōu)點根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性,理論上可以制成測定所有生物物質(zhì)的傳感器,因而測定范圍廣泛一般不需進行樣品的預(yù)處理,它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測組分的分離和檢測統(tǒng)一為一體，測定時一般不需另加其他試劑,使測定過程簡便迅速,容易實現(xiàn)自動分析體積小、響應(yīng)快、樣品用量少,可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測通常其敏感材料是固定化生物元件,可反復(fù)多次使用準(zhǔn)確度高,一般相對誤差可達到1%以內(nèi)可進行活體分析傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀,因而便于推廣普及有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作

18、用才能獲得的信息 3 生物傳感器優(yōu)點抗體對相應(yīng)的抗原具有識別和結(jié)合的雙重功能,在與抗原結(jié)合時,選擇性強,靈敏度高，免疫傳感器就是利用其雙重功能將抗體或抗原和換能器組合而成的裝置。由于蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)攜帶有大量電荷、發(fā)色基團等,當(dāng)抗原抗體結(jié)合時,會產(chǎn)生電學(xué)、化學(xué)、光學(xué)等變化,通過適當(dāng)?shù)膫鞲衅骺蓹z測這些參數(shù),從而構(gòu)成不同的免疫傳感器，總的來說可分為兩類: (1)非標(biāo)記型; (2)標(biāo)記型4. 免疫傳感器(Immunosensor)如黃曲霉毒素傳感器,它由氧電極和黃曲霉毒素抗體膜組成,加到待測樣品中,酶標(biāo)記的及未標(biāo)記的黃曲霉毒素便會與膜上的黃曲霉毒素抗體發(fā)生競爭反應(yīng),測定酶標(biāo)黃曲霉毒素與抗體的

19、結(jié)合率,便可知樣品中的含量4. 免疫傳感器(Immunosensor)在食品分析中的應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用在軍事上的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用5. 免疫傳感器的應(yīng)用 其實我們對傳感器并不陌生,例如酒后開車的酒精檢測儀器機場里的體溫檢測儀器煙霧感應(yīng)器等基礎(chǔ)研究：生物傳感器可實時監(jiān)測生物大分子之間的相互作用。借助于這一技術(shù)動態(tài)觀察抗原、抗體之間結(jié)合與解離的平衡關(guān)系，可較為準(zhǔn)確地測定抗體的親和力及識別抗原表位，幫助人們了解單克隆抗體特性，有目的地篩選各種具有最佳應(yīng)用潛力的單克隆抗體 。臨床應(yīng)用：用酶、免疫傳感器等生物傳感器來檢測體液中的各種化學(xué)成分，為醫(yī)生的診斷提出依據(jù)。 生物醫(yī)藥： 利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)藥物時，將生物傳感器用于生化反應(yīng)的監(jiān)視，可以迅速地獲取各種數(shù)據(jù)，有效地加強生物工程產(chǎn)品的質(zhì)量管理。 5. 在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用免疫學(xué)其他實驗技術(shù)核酸分子雜交的探針標(biāo)記,Southern 印跡雜交聚合