大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件

1、體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交引言離體原生質(zhì)體最重要特性：具有彼此融合的能力動(dòng)物細(xì)胞融合只是個(gè)分析工具，而植物細(xì)胞融合為制造新雜種開(kāi)辟了一條新途徑。（為什么？）體細(xì)胞雜交：完全不經(jīng)過(guò)有性過(guò)程，只通過(guò)體細(xì)胞融合制造雜種的方法稱做體細(xì)胞雜交。針對(duì)：有性生殖能力很低或者不具備的植物（如，香蕉，馬鈴薯，甘薯，等）步驟：原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞選擇、雜種細(xì)胞培養(yǎng)、由雜種愈傷組織再生植株、雜種植株鑒定。引言離體原生質(zhì)體最重要特性：具有彼此融合的能力細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜 融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)

2、程。細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somaMuller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立

3、了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細(xì)胞融合研究進(jìn)展Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)青菜大豆馬唐草矮牽牛龍面花大麥花生大麥大豆小麥矮牽牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麥蠶豆大豆草香木犀酵母菌雞大豆煙草大豆秋水仙人胡蘿卜番茄馬鈴薯人小鼠葉葉葉根愈傷組織葉葉花瓣種子種子葉懸浮細(xì)胞葉花瓣葉懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉根懸浮細(xì)胞葉原生質(zhì)體血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞葉腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)

4、體葉根尖纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間葉葉1972幾種細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 動(dòng)植物細(xì)胞的融合過(guò)程植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖動(dòng)植物細(xì)胞的融合過(guò)程植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖細(xì)胞融合的意義理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這 對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)

5、緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。細(xì)胞融合的意義理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為細(xì)胞融合的基本原理細(xì)胞融合的基本原理顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過(guò)程圖解融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過(guò)程圖解用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 細(xì)胞融合的常用方法細(xì)胞融合的常用方法自發(fā)

6、融合在酶解細(xì)胞壁過(guò)程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體，每個(gè)同核體包含240個(gè)核，這種類型的原生質(zhì)體融合叫自發(fā)融合。原理：由不同細(xì)胞間的胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成用藥物切斷胞間連絲可減少自發(fā)融合的頻率自發(fā)融合一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞 膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需 要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：病毒促使細(xì)胞融合的主

7、要步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過(guò)病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定

8、1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。PEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。二、聚乙二醇（PEG）聚乙二醇（PEG）處理是應(yīng)用非常廣泛的方法。高國(guó)楠(1974)用聚乙二醇(PEG)為融合劑誘發(fā)大豆與大麥、大豆與玉米、哈加野豌豆與豌豆的融合。此法比病毒更易制備和控制,活性穩(wěn)定,用PEG作為病毒的替代物誘導(dǎo)細(xì)胞融合。在PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效濃度范圍內(nèi)(50%55%)對(duì)細(xì)胞的毒性應(yīng)進(jìn)一步減小。異核體

9、形成頻率高，可重復(fù)性強(qiáng)，毒性低，特異性低。聚乙二醇（PEG）處理是應(yīng)用非常廣泛的方法。聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合PEG誘導(dǎo)融合的真正機(jī)制不完全明了。可能的作用機(jī)制：由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成化學(xué)鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋在相鄰原生質(zhì)體間起分子橋的作用，促進(jìn)粘連。進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合使膜緊密接觸

10、區(qū)電荷重新分配，導(dǎo)致帶不同電荷的基團(tuán)連接，最終引起融合。PEG使膜內(nèi)蛋白或糖蛋白顆粒凝聚，使脂膜中出現(xiàn)不含蛋白質(zhì)的雙層脂類分子區(qū)，膜融合的部位就在這些區(qū)域。另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的真正機(jī)制不完全明了。聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本細(xì)胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624

11、小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟影響PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的因素：除了課本所列的11條，原生質(zhì)體的來(lái)源（即其來(lái)自什么物種）也可影響誘導(dǎo)的效果。影響PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的因素：三、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害?。谎b置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。缺點(diǎn)：融合產(chǎn)物少，設(shè)備昂貴。三、電融合法 電

12、融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)電融合的基本過(guò)程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 電融合的基本過(guò)程：電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖四、鹽類融合法（NaNO3處理）最早獲得體細(xì)胞雜種的方法，但異核體形成頻率不高。鹽類融合劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞小。今后研究應(yīng)提高其融合率,使其對(duì)液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體能夠誘發(fā)融合。四、鹽類融合法（NaNO3

13、處理）五、高pH-高濃度鈣離子處理Keller首先發(fā)現(xiàn)高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)融合。Melchers用此法將煙草種內(nèi)2個(gè)光敏感突變體誘導(dǎo)融合成功并獲得100余株體細(xì)胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問(wèn)題。雜種產(chǎn)量較高，但對(duì)有些原生質(zhì)體系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，高pH可能有毒。五、高pH-高濃度鈣離子處理原生質(zhì)體融合過(guò)程：凝聚作用階段；粘連、融合階段；異核或同核體形成階段注意：凝聚的原生質(zhì)體未必都能最終融合。膜融合發(fā)生的條件：膜的貼近程度相當(dāng)于分子距離1nm或更小。中和原生質(zhì)體正常的表面電荷可使凝聚原生質(zhì)體的質(zhì)膜緊密接觸。高溫可引起質(zhì)膜中脂類分子的紊亂，然后通過(guò)在緊密粘連的質(zhì)膜中脂類分子的互作和混合，

14、導(dǎo)致融合?；瘜W(xué)誘導(dǎo)融合的機(jī)制原生質(zhì)體融合過(guò)程：凝聚作用階段；粘連、融合階段；異核或同核體六、空間細(xì)胞融合技術(shù)。植物細(xì)胞融合過(guò)程中由于地球重力的存在,有無(wú)液泡的原生質(zhì)體密度差很大,異源細(xì)胞融合率低。在利用動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程中,在地面上由于無(wú)法排除地球重力的影響,要提高B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難。20世紀(jì)80年代以來(lái),在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下,試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù)六、空間細(xì)胞融合技術(shù)。植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 右瓶為地面融合的細(xì)胞 植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 幾百斤重的太空南瓜太空辣椒幾百斤

15、重的太空南瓜太空辣椒融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué) 首先形成雙核異核體兩個(gè)核有可能同步進(jìn)行第一次有絲分裂，形成2個(gè)雜種子細(xì)胞（雙親親緣關(guān)系較近）雙親之一的染色體會(huì)逐漸消除。（親緣關(guān)系較遠(yuǎn)）融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué)兩個(gè)核有可能同步進(jìn)行第一次有絲分裂，形成2個(gè)雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)一、互補(bǔ)選擇法1.激素自主性互補(bǔ)根據(jù)其對(duì)外源激素的需求差異雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)一、互補(bǔ)選擇法大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件2.對(duì)培養(yǎng)基反應(yīng)及對(duì)抗性代謝物敏感性互補(bǔ)只有雜種細(xì)胞對(duì)抗性代謝物不敏感。2.對(duì)培養(yǎng)基反應(yīng)及對(duì)抗性代謝物敏感性互補(bǔ)3.野生型與白化突變互補(bǔ)兩種矮牽牛雜種細(xì)胞可以形成綠色愈傷組織（具柔毛） 3.野生型與白化突變互補(bǔ)4.

16、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)及抗性互補(bǔ)注意：抗性必須為顯性4.營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)及抗性互補(bǔ)二、機(jī)械分離法1.根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)志選擇2.根據(jù)熒光標(biāo)記選擇3.低密度植板選擇二、機(jī)械分離法體細(xì)胞雜種植株的核型少數(shù)幾種是雙二倍體，染色體數(shù)恰為兩個(gè)親本染色體數(shù)之和。多數(shù)情況下，染色體數(shù)會(huì)發(fā)生偏差。原因?yàn)椋?.核質(zhì)互作2.兩個(gè)以上原生質(zhì)體發(fā)生了融合3.原生質(zhì)體自發(fā)融合既然這么容易偏差，為什么還要做體細(xì)胞雜交？只要一個(gè)親本的部分染色體能夠充分整合到另一個(gè)親本的染色體組中，那么染色體的選擇性丟失可能會(huì)有其好處。體細(xì)胞雜種植株的核型少數(shù)幾種是雙二倍體，染色體數(shù)恰為兩個(gè)親本細(xì)胞質(zhì)雜種在有性雜交中，細(xì)胞質(zhì)基因組只是來(lái)自雙親之一（母

17、本），而在體細(xì)胞雜交中，雜種卻擁有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)，有可能使兩種來(lái)源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起，這種雜種稱作細(xì)胞質(zhì)雜種（cybrid）。細(xì)胞質(zhì)雜種在有性雜交中，細(xì)胞質(zhì)基因組只是來(lái)自雙親之一（母本）體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定方法根據(jù)F1植株的形態(tài)特征核核型分析，即可對(duì)體細(xì)胞雜種核胞質(zhì)雜種進(jìn)行鑒定。也可應(yīng)用生化和分子生物學(xué)的手段進(jìn)行鑒定。體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定方法以馬鈴薯栽培種(S. tuberosum)中薯二號(hào)的無(wú)性系3#、8#(2n=48,四倍體，中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉所)和二倍體野生種S. chacoense(2n=24，二倍體)的無(wú)菌

18、苗為原生質(zhì)體來(lái)源。試管苗培養(yǎng)采用MS基本培養(yǎng)基(2%蔗糖, 07%瓊脂, pH58),每天光照16 h,光強(qiáng)30004000 lx,溫度(201)。原生質(zhì)體融合采用PEG (聚乙二醇)融合6和電融合7的方法蔡興奎等，采用野生種S. chacoense與四倍體栽培種進(jìn)行原生質(zhì)體融合,旨在獲得抗青枯病的新材料,為馬鈴薯抗青枯病育種提供抗性材料,同時(shí)為倍性育種奠定基礎(chǔ)以馬鈴薯栽培種(S. tuberosum)中薯二號(hào)的無(wú)性馬鈴薯馬鈴薯大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件形態(tài)學(xué)觀察形態(tài)學(xué)觀察株型差異株型差異大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)12體細(xì)胞雜交-組培課件通過(guò)原生質(zhì)體攝入細(xì)胞器、微生物和DNA進(jìn)行細(xì)胞的遺傳飾變一、葉綠體移殖研究葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，并通過(guò)比較葉綠體和原生質(zhì)體基因組，研究葉綠體在植物發(fā)育中的起源和演化。進(jìn)行葉綠體移植的試驗(yàn)，并探索葉綠體作為外源基因載體的可能性。通過(guò)原生質(zhì)體攝入細(xì)胞器、微生物和DNA進(jìn)行細(xì)胞的遺傳飾變一、二