細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

1、1目的1.1 了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化試驗(yàn)反應(yīng)原理1.2掌握測(cè)定細(xì)菌生理生化反應(yīng)的技術(shù)和方法2原理各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。由于細(xì)菌特有的單細(xì)胞 原核生物的特性，這種差異就表現(xiàn)的更加明顯。不同細(xì)菌分解、利用 糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也 不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物 學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒 定中仍有很大作用。3材料3.1菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgari

2、s)、枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的斜面菌種3.2培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖、 乳糖或蔗糖)3.3試劑40%NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲噪試劑、乙醚、1.6%漠甲基 酚紫指示劑。3.4器具超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。4流程糖發(fā)酵試驗(yàn)一V-P試驗(yàn)一甲基紅試驗(yàn)一吲噪試驗(yàn)5步驟糖類發(fā)酵試驗(yàn)1目的了解不同細(xì)菌分解利用糖的能力及實(shí)驗(yàn)原理，并掌握其操作方法.2原理可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌 種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑漠甲酚紫(即 B.C.P指示劑，其p

3、H在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色)， 經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基 中放入倒置杜氏小管觀察。3材料3.2菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、普通變形桿菌(Proteus vulgaris )的斜面 菌種3. 3培養(yǎng)基葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管4流程發(fā)酵液試管一標(biāo)記一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1試管標(biāo)記圖9-1糖發(fā)酵產(chǎn)氣取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各A不產(chǎn)氣；B產(chǎn)氣4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變 形菌和空白對(duì)照。5.2

4、接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng) 液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中（圖9-1），置37C恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。5.3觀察記錄與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表 明該菌不能利用該種糖，記錄用“一 ”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié) 果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用H”表示。培養(yǎng)液中 的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記 錄用“+”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“一”表示。（二）乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V. P試驗(yàn)）1目的了解鑒別不同腸桿

5、菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操 作方法.2原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮 酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧 化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP( + ) 反應(yīng)。3材料3.1菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的斜面菌種3.2培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管4流程培養(yǎng)液試管一標(biāo)記一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1標(biāo)記試管取5

6、支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。5.2接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。5.3觀察記錄取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加 入35ml以上對(duì)應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入40%NaOH溶液1020 滴，并用牙簽挑入約0.51mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的 氧溶入，置37C恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記 錄為V.P.試驗(yàn)陽性反應(yīng)（用“+”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“一”表示）。注意：原試管中留下的

7、培養(yǎng)液用作甲基紅試驗(yàn)。（三）甲基紅試驗(yàn)（M.R .試驗(yàn)）1目的了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法.2原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸， 進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸 和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲 基紅指示劑變紅。3材料3.1菌種同V. P試驗(yàn)3.2培養(yǎng)基同V. P試驗(yàn)4流程培養(yǎng)液一指示劑一觀察一記錄結(jié)果5步驟于V.P.試驗(yàn)留下的培養(yǎng)液中，各加入23滴甲基紅指示劑，注意沿 管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性 反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“+”

8、或“一”表示。（四）吲噪試驗(yàn)1目的掌握吲噪試驗(yàn)（Ehrlich法）的原理和方法2原理有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲噪（靛基質(zhì)）。吲噪本身沒有顏色，不能直接看見，但當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯 甲醛試劑時(shí)，該試劑與吲噪作用，形成紅色的玫瑰吲噪。3材料3.1菌種測(cè)試菌株.3.2培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基3.3試劑二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。4流程標(biāo)記試管一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1試管標(biāo)記取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管5支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。5.2接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，第5管作空白對(duì)照 不接種，置37C恒溫箱中

9、培養(yǎng)2448h。5.3觀察記錄在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲噪萃取至乙醚中，靜 置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入510滴吲 噪試劑（加入吲噪試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀 察），如有吲噪存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲噪試驗(yàn)陽性反應(yīng)， 否則為陰性反應(yīng)，陽性用“+”、陰性用“一”表示。6結(jié)果記錄生理生化反應(yīng)測(cè)定結(jié)果.細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康撵柟涛⑸餆o菌接種技術(shù)；了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)的原理和方法微生物的生理生化反應(yīng)微生物細(xì)胞在酶的催化下進(jìn)行各種各樣的生理生化反應(yīng)把微生物細(xì)胞在一定的條件下培養(yǎng)，通過觀察生理現(xiàn)象和檢查代謝產(chǎn) 物，可以了解微生

10、物的代謝過程和代謝的特點(diǎn)由于不同的微生物可能具有不同的酶，代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能也有 不同，生理生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要指標(biāo)之一.淀粉水解實(shí)驗(yàn)淀粉培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基+接種+變色圈，水解圈培養(yǎng)24h加盧哥氏碘液I-KI結(jié)果：有水解圈淀粉水解實(shí)驗(yàn)陽性，用+表示；無水解圈淀粉水解實(shí)驗(yàn)陰性，用-表示；糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)原理：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，甲酸在酸性條件下在甲酸氫解酶作用下可進(jìn)一步裂解生成H2和CO2產(chǎn)酸產(chǎn)氣缺少甲酸氫解產(chǎn)酸不產(chǎn)氣步驟:配制糖發(fā)酵培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）觀察結(jié)果結(jié)果：紫色無氣泡,既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用-表示；黃色無氣泡，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，用+表示；黃色且有氣泡，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，用0表示.

11、甲基紅實(shí)驗(yàn)（M.R實(shí)驗(yàn)）原理微生物進(jìn)行混合酸發(fā)酵，產(chǎn)生各種有機(jī)酸一pH下降加入指示劑甲基紅紅色步驟:配制蛋白胨水培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）加入指示劑甲基紅12滴觀察結(jié)果結(jié)果：紅色M.R實(shí)驗(yàn)陽性，用+表示；不變色一M.R實(shí)驗(yàn)陰性，用-表示；V.P實(shí)驗(yàn)V.P實(shí)驗(yàn)步驟:配制蛋白胨水培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）510d40%KOH, 510d 5%a-奈酚和少量肌 醇，取出塞子，用力震蕩，保溫（37度1530min）觀察結(jié)果結(jié)果：紅色V.P實(shí)驗(yàn)陽性，用+表示；不變色一V.P實(shí)驗(yàn)陰性，用-表示.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以組為單位進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn),糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),V.P實(shí)驗(yàn)和M.R實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)菌種：淀粉水解實(shí)驗(yàn)，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn):大腸桿菌，蘇云金芽孢桿菌V.P實(shí)驗(yàn)和M.R實(shí)驗(yàn):大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌汪意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)報(bào)告：列表記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果思考題:第4小題四大類細(xì)胞型微生物菌落的鑒定初步鑒定確證:顯微鏡觀察微生物菌落特征的記錄和描述菌落形態(tài):形狀