動物細胞培養(yǎng)原理

1、2.2.2.2 飼養(yǎng)細胞制備在雜交瘤細胞的培養(yǎng)過程中，融合后大量骨髓瘤細胞和脾細胞在 HAT 培養(yǎng) 液中相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的細胞不易存活，必須加入其他細胞方能使 之生存，這種被加入的活細胞稱為飼養(yǎng)細胞。一般選用正常小鼠的腹腔巨噬細胞 作為飼養(yǎng)細胞。在細胞融合前的 1 天制備飼養(yǎng)細胞。將健康的 Balb/c 小鼠眼球放血后拉頸脫臼處死，浸泡于 75%酒精中 消毒35min,隨即放入超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上固定于解剖臺板上。用鑷子提起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，暴露一小塊腹膜，再換 把剪刀將暴露的腹膜剪一個小口。用滴管吸取適量的不完全RPMI-1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔。反復抽吸、 沖洗

2、腹腔34次。( 4)抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管內(nèi)。lOOOrpm 離心 10min,棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)液將沉淀細胞懸浮并混勻，做細胞計數(shù)，根據(jù)細胞 計數(shù)結(jié)果，補加HAT培養(yǎng)液，使細胞濃度為2x105個/ml。將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 m然后將培養(yǎng)板置37C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。該項操作及以后的操作都必須嚴格無菌操作。2.2.2.3 脾細胞的準備取已經(jīng)免疫的 Balb/c 小鼠，摘除眼球放血，并分離血清供檢測抗體時 的陽性對照用。同時將小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精中5min，隨即放入 超凈臺內(nèi)。在小鼠腹壁上剪一小口，撕開皮膚，用滅菌鑷子提起腹膜，剪開左

3、側(cè) 腹膜及肋骨，暴露脾臟，換用另一套滅菌器械，用鑷子提起脾臟，分離結(jié)締組織， 取出脾臟。放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，輕輕沖洗一次。再將脾臟移入另一盛有 5ml 不完全培養(yǎng)液的平皿中，再沖洗一次，然 后用剪刀剪碎。將脾臟碎塊裝入勻漿器中，充分研磨。之后用不完全培養(yǎng)液沖洗勻漿 器，待大的組織塊沉降后，吸取上層的細胞移入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng) 液至30ml，混勻。1000rpm離心5min，棄去上清。沉淀細胞再用不完全培養(yǎng)液同法離心洗滌一次。然后將細胞重懸至 10ml，混勻。取脾細胞懸液活細胞計數(shù)后備用。2.2.2.4 SP2/0 骨髓瘤細胞的準備 骨髓瘤細胞的狀況直接影響融合結(jié)果，

4、生長良好的細胞透亮，邊緣光滑清晰。在細胞融合前一周左右復蘇SP2/0骨髓瘤細胞，并在細胞融合前36 48h 將骨髓瘤細胞擴大培養(yǎng)。使細胞在融合時正處于對數(shù)生長期。一般融合一次 用的細胞數(shù)是長到95%左右的75mm2培養(yǎng)瓶4-5瓶。融合時將SP2/0骨髓瘤細胞從瓶壁上吹下，收集于50ml離心管內(nèi)。lOOOrpm離心5min,棄去上請。用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后活細胞計數(shù)，取所需細胞數(shù)，用不完全培 養(yǎng)液洗2次，以10ml不完全的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮備用。2.2.2.5 細胞融合將已制備好的脾細胞及SP2/0骨髓瘤細胞混合于滅菌的50ml離心管中，兩 種細胞之比為10： 1, lOOOrpm離

5、心8min,棄上清，重復上述離心一次后盡量棄 去上清。用手指輕輕彈擊離心管底部，使沉淀的細胞松散均勻。將離心管傾斜， 一手均勻地轉(zhuǎn)動離心管，另一手用1ml吸管勻速加入1ml 37C預熱的50% PEG, 從加入到加完的時間控制在60s左右，邊加邊攪拌。加完后，慢慢搖晃30s，再 靜置60s。立即在隨后的5min內(nèi)加入10ml預熱的37C不完全培養(yǎng)液，使PEG 稀釋而失去促融作用。在第一分鐘和第二分鐘分別加1ml,第三分鐘和第四分鐘 分別加入2ml,第五分鐘將剩余液體加完。邊加邊輕輕攪動使PEG和終止液充 分混合，動作應輕柔。隨后再補加30ml不完全培養(yǎng)液，800rpm離心6min,棄 去上清，

6、加入10ml HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀的細胞，使其懸浮并混勻。根據(jù) 所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，按一塊96孔細胞培養(yǎng)板10ml計算補加完全培養(yǎng)液之 所需量。將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，每孔100卩1., 37C、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。融合后的第三天更換培養(yǎng)液一次，換液時吸去 1/2 培養(yǎng)液，加入等量新鮮 HAT 培養(yǎng)液。以后每隔兩天換液一次。觀察骨髓瘤細胞都死后，大約第七天左 右可以換用HT培養(yǎng)液。仔細觀察融合細胞的生長狀況，凡有污染的孔應立即滴 加1%的NaOH,以免污染擴散，如果細胞生長太慢可補加1次飼養(yǎng)細胞。 2.2.2.6 雜交瘤細胞的篩選融合后，一般過七天開始

7、尋找并記錄雜交瘤的生長情況，當雜交瘤細胞長至 一個視野的一半以上時，可用建立好的間接ELISA方法檢測抗體分泌情況，篩 選陽性克隆。取細胞培養(yǎng)上清100卩1加入已包被好抗原的酶標板中，細胞培養(yǎng)孔 補加100卩1培養(yǎng)液，其中兩孔加入SP2/0培養(yǎng)上清作為陰性對照。兩孔加入稀釋 1000倍的多抗血清作為陽性對照，被檢測孔OD值大于陰性孔4倍以上判定為 陽性。陰性孔3天后再檢測一次，如仍為陰性則棄之。融合比較好的陽性孔應該 與陽性對照相近的。檢測的陽性孔雜交瘤細胞立即全部轉(zhuǎn)入24孔細胞培養(yǎng)板培 養(yǎng)。1 天后觀察細胞生長良好即可用于克降化。2.2.2.7 雜交瘤細胞的克隆雜交瘤細胞克隆化的方法有很多種

8、，如有限稀釋法、軟瓊脂平板法、單細胞 顯微鏡操作法和熒光活細胞分類法，我們所采用的是有限稀釋法。一般第一次克 隆化時，用HT培養(yǎng)液稀釋。制備飼養(yǎng)細胞?？捎诳寺』耙惶熘苽?，也可于克隆化當天制備。將待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反復吹打均勻后，取少許細胞懸浮至 另一無菌青霉素小瓶中。細胞計數(shù)并根據(jù)計數(shù)結(jié)果，對細胞懸液做適當稀釋。取130個活細胞懸浮于6.5ml(終體積)培養(yǎng)液中此時平均每0.1溶液中含2 個細胞，接種96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml,共36孑L。這樣就用去3.6ml。余下2.9ml, 再加入2.9ml培養(yǎng)液，共5.8ml(此時平均每0.1溶液中含1個細胞)，接種此細胞 液至其次的36

9、 孔,每孔0.1ml。最后剩余細胞懸液2.2ml，再補加培養(yǎng)液2.2ml(此 時平均每0.1ml溶液中含細胞0.5個)，接種最后的24孔，每孔0.1ml。這樣共以 三種不同的細胞濃度進行克隆化，第一組36孔，平均每孔5個細胞，第二組36 孔，平均每孔1個細胞，第三組24孔平均每孔0.5個細胞。將培養(yǎng)板置5%CO2、37C孵箱中培養(yǎng)。一般5d左右(在此之前不換液) 即可在倒置顯微鏡下觀察細胞克隆生長，注意確定單克隆細胞株。適時進行換液及檢測。有多孔陽性時，應盡可能取單克隆孔繼續(xù)進行再 次克隆化，同時轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng),直至所有細胞孔 的培養(yǎng)上清液均為陽性。2.2.2.8

10、雜交瘤細胞的凍存和復蘇細胞凍存每次克隆均要凍存510個陽性雜交瘤細胞株。選擇生長旺盛、形態(tài)良好的 處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕將細胞從瓶壁上吹下，1000rpm離心10min,棄上清， 收集細胞沉淀；用凍存液(20%小牛血清，70%不完全培養(yǎng)液，10%DMSO)將 細胞沉淀懸浮，分裝于凍存管中，加蓋封嚴，并注明細胞代碼、凍存日期。凍存 液最好預冷，操作動作要輕柔、迅速。將凍存管先4C放置1h，之后-20C放置 1h,最后放入-80C長期保存。細胞復蘇準備一個干凈盛有37C溫水的燒杯，自-80C冰箱中取出一只凍存管，立即 放入盛水的燒杯中，細胞部分浸入水中融化，1000rpm離心5min，而后移入超 凈工作臺，無菌開啟凍存管，吸去上清，加入1 mlRPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細 胞沉淀，移入細胞培養(yǎng)瓶中，再加入46ml RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置37C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.2.2.8.3 腹水的制備采用體內(nèi)誘生腹水法制備。選擇812周齡小鼠，將0.5ml高壓滅菌的液體 石蠟注射到小鼠腹腔，以促進腹腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的分泌和聚集。一周后取大瓶培養(yǎng) 的處于對數(shù)生長期的陽性雜交瘤細胞株，1000rpm離心10min,棄去上清液，用 不完全培養(yǎng)液懸浮細胞