實驗五擬南芥插入突變純合體的鑒定

1、關于實驗五擬南芥插入突變純合體的鑒定第1頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三實驗目的1熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；2掌握利用PCR方法鑒定擬南芥T-DNA插入突變體的方法。 第2頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三T-DNA插入鑒定的原理第3頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三突變體鑒定的步驟T-DNA插入基因的基因組序列；T-DNA插入方向的確定；T-DNA插入位置的確定；引物設計；PCR擴增；電泳檢測。第4頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三T-DNA插入基因的基因組序列第5頁，共20頁，2

2、022年，5月20日，22點10分，星期三點擊基因編號進入網頁第6頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三點擊sequence viewer進入第7頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三點擊nucleotide view進入 第8頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三點擊突變體編號后進入的網頁第9頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三進入網站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突變體及插入方向第10頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三第11頁，共20頁，2022年，5月20日，22點

3、10分，星期三基因方向T-DNA方向5引物3引物實驗設計第12頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三引物設計基因上面引物的設計可以通過下面提供的擬南芥網站/tdnaprimers.html進行自動生成，也可以根據自己的需要進行設計。一般進行鑒定的引物距離T-DNA插入的位置300bp以上為宜，即300+N bp。LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 第13頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三植物基因組DNA的快速提取 （1）取植物葉片（擬南芥一片葉子），置于1.5ml離心管中，

4、加入400 ml提取緩沖液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至緩沖液變?yōu)榫G色；（3）在臺式離心機上13000 rpm離心5分鐘；（4）離心后將上清300 ml轉移至一個新的1.5 ml離心管中；（5）在上清中加入300 ml異丙醇，混勻后于室溫下13000 rpm條件下，離心5分鐘；（6）棄上清后，用70%乙醇潤洗沉淀，并在室溫下干燥沉淀；（7）100 ml TE溶解沉淀，將制備好的樣品在4保存?zhèn)溆谩＃ù朔椒ㄌ崛〉幕蚪MDNA只適用于PCR的鑒定，不適合酶切和大片段基因的擴增）第14頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三PCR鑒定 30ml反應體系： 2ml 植物基因組DNA

5、樣品 3ml 10擴增緩沖液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用無菌水補足體積。第15頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三PCR反應條件94 3min30循環(huán)（94/1min，55/1min，72/1min）； 72 延伸10min。注：反應條件需根據所要擴增產物的大小和引物的性質進行合適的調整。第16頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三PCR安排每小組四個PCR反應，引物和DNA模板分別如下： 1.WT基因組模板2個P

6、CR反應：引物分別為基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。2.突變體基因組為模板2個PCR反應：引物分別為基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。第17頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三046號突變體的鑒定（1-6組） 30ml反應體系1： 2 ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反應體系2： 2 ml 植物基因組DNA樣品WT 3 ml 10擴增緩沖

7、液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 30ml反應體系3： 2 ml 植物基因組DNA樣品（111） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反應體系4： 2 ml 植物基因組DNA樣品（111） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 m

8、l dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 第18頁，共20頁，2022年，5月20日，22點10分，星期三135號突變體的鑒定（7-11組） 30ml反應體系1： 2ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反應體系2： 2ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L） 30ml反應體系3： 2ml 植物基因組DNA樣品（111） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反應體系4： 2ml 植物基因組DNA樣品（111） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml