流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用高瀛岱

1、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種 信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：液流系光學(xué)系數(shù)據(jù)處理系細(xì)胞分選細(xì)胞分選原理通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行（一）分選基本原理細(xì)胞懸液形成液流柱壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)室振動(dòng)（一）分選基本原理細(xì)胞懸液形成液流柱壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴不充電充棄偏轉(zhuǎn)落入收集器（二）分選的技術(shù)

2、要求分選速度：時(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與（二）分選的技術(shù)要求分選速度：時(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與液中細(xì)胞的含量分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。第二數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)數(shù)據(jù)顯示方第二數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)一參FS：反映顆粒的大小一參FS：反映顆粒的大小SS結(jié)構(gòu)復(fù)雜程FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式直分析方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖

3、三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置（一）單參數(shù)直方由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)（一）單參數(shù)直方由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒 細(xì)胞相對(duì)數(shù)量 細(xì)胞相對(duì)數(shù)量（二）雙參數(shù)（二）雙參數(shù)直方雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的 是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖紅色熒光強(qiáng)度1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖紅色熒光強(qiáng)度2. 由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖2. 由類似地圖

4、上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞所代表的細(xì)曲線層次越高(越里面的線)數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。二維等二維等高圖 3. 假三3. 假三維等（三）三（三）三參數(shù)直方（四）流式細(xì)胞（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析三、設(shè)門分析技術(shù)Gate設(shè)三、設(shè)門分析技術(shù)Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。A淋巴細(xì)胞單A淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞 中性粒

5、細(xì)胞A、B、C均為任意門線性線性第四流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)第四流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要樣標(biāo)記染色液相質(zhì)量控制技術(shù)一、免疫檢測(cè)樣品單細(xì)胞懸液外巴細(xì)胞樣品的一、免疫檢測(cè)樣品單細(xì)胞懸液外巴細(xì)胞樣品的分離單個(gè)核細(xì)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品使貼壁細(xì)胞脫落蛋白酶洗機(jī)械吹尼龍網(wǎng)新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年乙醇或甲醇保存法（2周或多聚保存法（2月Sorting1%Sorting1%Fetalrum(Heat- 1PhosphateBufferSalineorHBSS (Ca/Mg+ fr

6、ee)1mM25mMHEPESpH高本Sortingbuffer加5mMMgCl2以及2550DNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mM MgCl2以及高本Sortingbuffer加5mMMgCl2以及2550DNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mM MgCl2以及20 U DNAase II (Sigma D-4138)。這些 方出來(lái)的DNA所 成的細(xì)胞黏聚現(xiàn)象(Adherent以Trypsin處 后去準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液時(shí)，待細(xì)胞變 (不可過(guò)度作用)，便以5 ml 含離心后，用sortingbuffer調(diào)整細(xì)

7、胞濃度 如果需要的話，可以提高EDTA的濃度(至 二、常用的與標(biāo)記染盡 選擇熒光光譜重PE-Cy5/APC&二、常用的與標(biāo)記染盡 選擇熒光光譜重PE-Cy5/APC&PerCP-CD62Lon擾聯(lián)APC-Cy7/PE-2Minimizethepotentialforspectral2MinimizethepotentialforspectralSpilloverestimateshespectra（一）幾種常見(jiàn)的熒細(xì)異酸（一）幾種常見(jiàn)的熒細(xì)異酸熒激Texas 得州能量傳遞復(fù) 常用的幾類熒光名波溶解特異硫 酸熒綠易敏易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅 常用的幾類熒光名波溶解特異硫 酸熒綠易敏

8、易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅不不敏橙易不敏光系數(shù)和量子產(chǎn)額高紅能量傳遞復(fù)紅易不敏減少交叉，成本高能量傳遞復(fù)合用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的結(jié)合在一能量傳遞復(fù)合用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)另一熒產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)機(jī)能量傳遞復(fù)機(jī)藻紅蛋花青苷血液系血液系統(tǒng)單細(xì)胞分選標(biāo)準(zhǔn)化的建立背干細(xì)胞的研究背干細(xì)胞的研究意義現(xiàn)在已經(jīng)越來(lái)越重要越來(lái)越顯示干細(xì)胞自我更新及化的分子機(jī)制都是在單細(xì)胞水平上發(fā)生的細(xì)組及表觀遺傳學(xué)分析、免疫缺擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題所有的擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題所有的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，干細(xì)胞的單胞分選

9、是最為關(guān)鍵，也是最為基礎(chǔ)的一環(huán)節(jié)。影響單細(xì)胞分選效果有很（比如目的分離細(xì)胞群的不同，分選的器選的選擇，不同光顏色之間的補(bǔ)償計(jì)算，樣品的準(zhǔn)備，集工具的不同單細(xì)胞分選的標(biāo)準(zhǔn)化建立非常重要，尤我研究對(duì)研究工作主要以血液系統(tǒng)更加有意義研究目通研究目通過(guò)對(duì)機(jī)器參數(shù)的調(diào)整，激光功確認(rèn)，補(bǔ)償?shù)牧炕幚?，接收工具的模研究方熒光抗體的選擇研究方熒光抗體的選擇分選儀器的比較補(bǔ)償計(jì)算的量化精確調(diào)整接收工具的模板標(biāo)準(zhǔn)化單細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定熒光抗體熒光抗體的選擇正常造血干細(xì)胞分選標(biāo)記：Lin-CD45RA-白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記：CD34+CD38-CD90-CD117-正常造血干細(xì)胞分選標(biāo)記Lin-Sca-1+c-Kit

10、+CD34- Flk2- 或者 Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9AML白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記Lin- Sca-1-c-Kit+ CD16/32+CD34+ c-Kit+Gr-1-BCR-ABLCML白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記Lin- 分選儀器的比較石英分選儀器的比較石英杯激發(fā)空氣激發(fā)補(bǔ)償計(jì)算補(bǔ)償計(jì)算的量化精確調(diào)整補(bǔ)償微球（comp-beads），標(biāo)陽(yáng)補(bǔ)償管，進(jìn)行上樣通過(guò)圈接收工具的模板接收工具的模板標(biāo)準(zhǔn)化因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的需求不同，所以單細(xì)選到不中，這其中包括24孔板96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每個(gè)器上調(diào)整相應(yīng)模板，使其固定為標(biāo)準(zhǔn)化單細(xì)胞的培養(yǎng)鑒將單細(xì)胞的培養(yǎng)鑒將分好的單細(xì)胞至于相應(yīng)的培養(yǎng)進(jìn)行14天培養(yǎng)，培養(yǎng)后對(duì)每板細(xì)胞存活1IMDM + 10%FBS+ SCF100ng/mL TPO50ng/mL+ Flt3L14技術(shù)路技術(shù)路CD34