菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測定及其指紋圖譜研究

1、菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測定及其指紋圖譜研究【摘要】目的建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物的HPL含量測定方法，并對提取物HPL指紋圖譜條件進展研究分析。方法采用反相18柱4.6200，5，甲醇0.5%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫，柱溫為25，流速為0.8l/in，在276n下進展檢測。結(jié)果菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖的含量為85.7g/g，加樣回收率為92.49%；1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖的含量為244g/g，加樣回收率為96.41%；初步討論了菱角皮提取物的指紋圖譜條件。結(jié)論采用高效液相法測定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合

2、物的含量，簡便、快速、準(zhǔn)確；初步得到別離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，為以后建立指紋圖譜和制定菱角皮藥材及其活性提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了根據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】菱；果皮；鞣酸；高效液相色譜；指紋圖譜Abstrat：bjetiveTestablishdeterinatinethdftanninpundsfrbiativeethylaetateextratfthefruitrustfTrapabispinsaRxbbyHPL,andtstudynanalysisnditinsfHPLfingerprintftheextrat.ethdsUsereversephase18lun4.6200，5,deteti

3、nave-lengthat276n,lunteperatureat25,flrateata0.8l/in,andgradientaqueusethanlslutinntaining0.5%aetiaidasabilephase.ResultsThedeterinatinftanniaidpund1,2,6-tri-gallyl-D-glusefrtheextratas85.7g/g,andtheaveragereveriesas92.49%;thedeterinatinftanniaidpund1,2,3,6-tetra-gallyl-D-gluseas244g/g,andtheaverage

4、reveriesas96.41%;apreliinarystudynnditinsfHPLfingerprintfrthebiativeextratasarriedut.nlusinThedeterinatinethdfrthetanninpundsfrethylaetateextratfthefruitrustftheplantbyHPLissiple,fastandaurate.hratgraphinditinsfethylaetateextratftheplantasinitiallybtained,hihprvidethebasisfrestablishentftheHPLfinger

5、printandakingqualitystandardftherudedruganditsbiativeextratfrtheplant.Keyrds：TrapabispinsaRxb;Fruitrust;Tannin;HPL；Fingerprint菱TrapabispinsaRxb，一年生浮水或半挺草本，屬菱科。我國有15種和11變種，產(chǎn)于全國各地，以長江流域亞熱帶地區(qū)分布與栽培最多1。其性甘味涼，無毒，入腸、胃二經(jīng)，有清熱祛暑、除濕祛風(fēng)、益氣健脾之功2。菱殼，為菱科植物菱或其同屬植物的果皮。其作為藥物始載于?本草綱目拾遺?。據(jù)?中華藥海?所載，其性味微苦、澀，涼，入肺、脾、大腸三經(jīng)，具有

6、解毒療瘡、澀湯止瀉、清化濕熱的成效2。經(jīng)查閱文獻得知，東北菱T.anshuriaFlerv菱角的提取物確實有一定的抗腫瘤活性35。在我們的前期工作中，選取菱TrapabispinsaRxb的菱角皮作為研究對象，采用TT法對菱角皮提取物抗肝癌HepG2細(xì)胞活性成分進展活性追蹤，采用液液萃取提取物各極性部位，也證實了菱角皮醋酸乙酯提取物對HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用；采用反相18柱層析和sephadexLH-20排阻層析別離活性成分，得到兩個鞣質(zhì)類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖1和1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖2，對該兩個化合物進展了抗癌活性實驗，證實其對HepG2細(xì)胞有一定的

7、抑制作用待發(fā)表。此前，有研究說明存在于東北菱菱角中的沒食子酸具有誘導(dǎo)Hela腫瘤細(xì)胞凋亡的作用3。兩個化合物化學(xué)構(gòu)造式見圖1。本研究將對菱角皮的醋酸乙酯活性部位中鞣質(zhì)類化合物進展HPL定性定量方法研究，旨在建立HPL含量測定方法，并對菱角皮醋酸乙酯提取物HPL指紋圖譜條件進展研究分析。1儀器與材料1.1儀器AgilentTehnlgies1200Series高效液相色譜儀，電子天平AULABsartriusgrup，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA。1.2藥材菱殼為從湖南長沙購置的菱角第1批、江西采集的菱角第2批和購置的菱角第3批果實去肉后的硬殼，藥材經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為菱Trapabisp

8、insaRxb的果殼。藥材樣品留存于暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室。1.3標(biāo)準(zhǔn)品1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖1、1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖2和沒食子酸3對照品為本實驗室提純物,其中1和2為從該實驗提取物中別離得到，并經(jīng)光譜法鑒定構(gòu)造。甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技產(chǎn)品；其余試劑為分析純。2方法與結(jié)果2.1HPL定量分析2.1.1色譜條件色譜柱為依利特18柱4.6200，5；檢測波長：276n；柱溫：25；流動相：A甲醇，B0.5乙酸水溶液；梯度洗脫條件：010in，10%A20%A；1030in，20%A40%A；3032in，40%A100%A；3242in，100%A；4247i

9、n,10%A；流速：0.8l/in。在上述色譜條件下，化合物1峰的保存時間在20.55in左右，化合物2峰的保存時間在25.31in左右，化合物3保存時間在6.10in左右,并且別離度良好。對照品、供試品高效液相色譜圖見圖2。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.1.2對照品溶液的制備精細(xì)稱取化合物10.0023g，置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46g/l的化合物1標(biāo)準(zhǔn)液。精細(xì)稱取0.0041g，化合物2置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.82g/l的化合物2標(biāo)準(zhǔn)液。精細(xì)稱取化合物30.0021g，置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46g/l的化合物3標(biāo)準(zhǔn)

10、液。2.1.3供試品制備取菱角皮，粉碎成細(xì)粉，取粉末100g，用5倍量85%乙醇冷浸兩次，第1次為72h，第2次為48h，過濾前超聲兩個小時，過濾，合并冷浸液，濾液低溫60減壓回收乙醇，濃縮得菱角殼提取物。將此提取物用適量水100l混懸，再依次用石油醚50l、氯仿50l、醋酸乙酯50l萃取水混懸液各3次，減壓下蒸干溶劑，得醋酸乙酯提取物。2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取化合物化合物1，化合物2和對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0l，以甲醇定容至10l容量瓶中，制得不同濃度對照品溶液。精細(xì)汲取20l注入高效液相色譜儀，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸得化合物1方程：

11、Y=58399X-147.85，R=0.9996；化合物2方程：Y=52715X-241.24，R=0.9998。結(jié)果說明化合物1在0.00920.046g/l，化合物2在0,01640.082g/l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.1.5精細(xì)度實驗取化合物1對照品溶液，精細(xì)汲取20l進樣，重復(fù)進樣5次，測得化合物2峰面積平均值為1980.7，RSD為1.52%。2.1.6穩(wěn)定性實驗分別于0，1，2，4，8，12h對同一供試品溶液進樣測定，進樣量為20l，結(jié)果化合物1平均峰面積為1351.86，RSD為1.79%，化合物2平均峰面積為3622.48，RSD為1.24%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.

12、1.7重復(fù)性實驗精細(xì)稱定菱角皮醋酸乙酯提取物5份各0.0030g于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進樣測定。結(jié)果見表12。表1化合物1峰重復(fù)性實驗結(jié)果略表2化合物2峰重復(fù)性實驗結(jié)果略2.1.8加樣回收率實驗化合物1加樣回收率實驗:精細(xì)稱取化合物10.0026g于25l容量瓶，并精細(xì)稱取0.0021g菱角皮醋酸乙酯提取物于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度；再分別汲取該化合物1溶液1l和菱角皮醋酸乙酯提取物溶液5l于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度；汲取20l進樣測定，按該法平行測量3次。結(jié)果見表3。表3化合物1加樣回收率實驗結(jié)果略化合物2加樣回收率實驗：結(jié)果見表4。表4化合物2加樣回收

13、率試驗結(jié)果略2.1.9樣品含量測定精細(xì)稱取0.0030g菱角皮醋酸乙酯提取物于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進樣，重復(fù)進樣5次，測得化合物1峰面積平均值為1354.28，RSD為1.52%，化合物1含量為85.7g/g；化合物2峰面積平均值為3622.48，RSD為1.24%,化合物2含量為244g/g。2.2指紋圖譜研究2.2.1色譜條件色譜柱為依利特18柱4.6200，5；檢測波長：276n；柱溫：25；流動相：A甲醇，B0.5%乙酸水溶液；梯度洗脫條件：015in，10%A20%A；1530in，20%A50%A；3060in，50%A100%A；6065in，100%A

14、；6575in,10%A；流速：0.8l/in。2.2.2方法學(xué)驗證重復(fù)性實驗:精細(xì)稱定“2.1.3項下制備的菱角皮醋酸乙酯提取物0.0020g各5份于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進樣，各主要色譜峰相對保存時間和相對峰面積RSD小于1.5%。穩(wěn)定性實驗：已在“2.1.6項下證明了菱角皮醋酸乙酯提取物溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。精細(xì)度實驗：已在“2.1.5項下證明了該環(huán)境下測量精細(xì)度良好。指紋圖譜：選取不同產(chǎn)地藥材兩角菱皮和四角菱皮按“2.1.3項下要求制備醋酸乙酯提取物，并分別精細(xì)稱定0.0020g于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度，精細(xì)汲取20l進樣，所得譜圖與“2.3項下制備的菱角

15、皮醋酸乙酯提取物進展比照。結(jié)果見圖36。由圖35可得，3個藥材都在5.645，22.803，24.314，25.66，45.66，48.391，52.406in左右出現(xiàn)特征色譜峰。分別汲取化合物1，2，3對照品溶液于該色譜條件下進樣，可知5.645in色譜峰為沒食子酸，22.803in色譜峰為化合物1，25.66in色譜峰為化合物2。3討論本研究對菱角皮抗腫瘤活性部位兩個鞣酸類主要成分1，2,6-三沒食子酰-b-D-葡萄糖和1,2,4,6-四沒食子酰-b-D-葡萄糖首次進展了定量分析方法研究并進展了樣品HPL定量分析，首次初步分析了菱角皮醋酸乙酯提取物活性部位的HPL指紋圖譜。結(jié)果說明采用高效液相法可測定菱角皮醋酸乙酯提取物中兩個鞣酸類化合物的含量，具有簡便、快速、準(zhǔn)確特點，所建立的HPL提取物指紋圖譜分析方法可用于該活性部位質(zhì)量控制。選用文獻報道的流動相甲醇-0.5%乙酸水溶液進展別離，化合物1、2峰形良好，但是大量極性相對較低的雜質(zhì)吸附在色譜柱上無法洗脫,嚴(yán)重影響后續(xù)的含量測定。所以,本實驗采取固相萃取SPE和梯度洗脫步驟,去除這一些雜質(zhì)干擾,保證了后續(xù)HPL指紋圖譜和定量分析順利進展。初步得到別離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，也為以后進一步完善建立提取物指紋圖譜分析方法和制定菱角皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了根據(jù)。【參考文