腺病毒介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因在培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中的表達(dá)

1、腺病毒介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因在培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中的表達(dá)【摘要】觀察腺病毒介導(dǎo)人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子brain-derivedneurtrphifatr,BDNF基因在培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞Shannell,S中的表達(dá)，為視神經(jīng)損傷修復(fù)提供可靠的組織工程用的種子細(xì)胞。方法：在293細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增BDNF重組腺病毒adenvirallydeliveredBDNF,Ad-BDNF，采用蝕斑形成試驗(yàn)測(cè)定其感染滴度。體外培養(yǎng)SD大鼠源性的S，以Ad-BDNF感染培養(yǎng)的S，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響reversetransriptaseplyersehainreatin,RT-PR檢測(cè)BDNFRNA的表達(dá)，用免疫印跡技

2、術(shù)iunbltassay,esternBltting和酶聯(lián)免疫反響檢測(cè)enzya-linkediusrbentassay,ELISA培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)。結(jié)果：Ad-BDNF經(jīng)擴(kuò)增后可獲得較高感染滴度的重組腺病毒載體。在正常培養(yǎng)條件下未經(jīng)Ad-BDNF感染的S低表達(dá)BDNF，而感染3d后的S其BDNF表達(dá)明顯升高，表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，并能在感染21d后仍維持高表達(dá)趨勢(shì)。結(jié)論：Ad-BDNF可以介導(dǎo)BDNF基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的S中，后者可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)BDNF。【關(guān)鍵詞】視神經(jīng)損傷0引言視神經(jīng)作為特殊分化的中樞神經(jīng)，其損傷后部分微環(huán)境中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子neurtrphifatr,NT

3、F在其修復(fù)和再生的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子brain-derivedneurtrphifatr,BDNF就是較早被肯定的其中之一1。在體內(nèi)和離體實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，BDNF可維持、促進(jìn)外周神經(jīng)嵴和外胚層基板來(lái)源的多種感覺(jué)神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)和分化2，支持視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞retinalganglialell,RG的體外存活3，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和視神經(jīng)損傷中有重要意義。雪旺細(xì)胞Shannell,S的BDNF根底分泌量很有限4，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可使S具有高效分泌BDNF的才能，再將其通過(guò)組織工程學(xué)的方法移植到視神經(jīng)損傷部位，既能維持BDNF的有效作用濃度到達(dá)促進(jìn)視神經(jīng)修復(fù)和再生的目的，又能

4、防止BDNF給藥途徑上的不便。目前，采用腺病毒載體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)BDNF基因在體外培養(yǎng)的S中表達(dá)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們采用載有人BDNF基因的重組腺病毒Ad-BDNF感染SD大鼠源性S，從RNA和蛋白分子表達(dá)程度檢測(cè)BDNF基因在S中的表達(dá)情況并討論其進(jìn)一步意義。1材料和方法1.1材料所用Ad-BDNF系與中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院根底醫(yī)學(xué)研究所合作研制，本實(shí)驗(yàn)室保存，293細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保存。山羊抗S-100多克隆抗體、兔抗BDNF多克隆抗體Sataruz公司，Trizl總RNA提取液和RT-PR反響試劑盒Invitrgen公司，BDNF蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒Prega公司，新生SD乳鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)

5、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2方法1.2.1Ad-BDNF的擴(kuò)增及滴度測(cè)定正常培養(yǎng)的293細(xì)胞密度到達(dá)90%集合時(shí)，參加適量Ad-BDNF液，更換為含50L/L新生牛血清的DE培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)35d，搜集出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)ytpathieffet,PE的293細(xì)胞，在-80和37之間反復(fù)凍融3次，離心棄沉淀，病毒上清再經(jīng)sl線性密度梯度超速離心純化后搜集分裝于-80保存?zhèn)溆?。Ad-BDNF的感染滴度采用蝕斑形成試驗(yàn)測(cè)定。1.2.2SD大鼠源性S的培養(yǎng)將7日齡SD乳鼠脫頸處死后，剪取雙側(cè)坐骨神經(jīng)用含青霉素、鏈霉素均為500kU/L的PBS溶液浸洗、去除血污。神經(jīng)組織參加2.5g/L胰蛋白酶、2g/L型膠原酶混

6、合消化60in后終止，100目篩網(wǎng)過(guò)濾，搜集濾液，1000r/in離心5in，沉淀參加含100L/L胎牛血清的DE培養(yǎng)液重新懸浮，采用雙30in差速黏附法接種細(xì)胞，置于37，50L/L2條件下培養(yǎng)。接種24h后向培養(yǎng)液中參加10-5l/L/阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，24h后吸棄，更新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后3d更換1次培養(yǎng)液，至細(xì)胞交融后以2.5g/L胰蛋白酶消化傳代。采用山羊抗S-100多克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)展鑒定。選用第34代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.3Ad-BDNF感染S取密度為5108/L的S懸液2L接種到6孔板孔內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞密度大于80%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，根據(jù)不同I計(jì)算所需的病毒量，取相應(yīng)

7、體積的Ad-BDNF液參加孔內(nèi)，37，50L/L2條件下感染S，90in后吸棄，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.4RT-PR檢測(cè)BDNFRNA的表達(dá)以I分別為0即未感染對(duì)照組,50,100,200,400的病毒量感染S，感染后24h將各組S搜集于塑料離心管中，10000r/in離心10in，參加Trizl液0.1L使細(xì)胞充分裂解后參加氯仿0.02L抽提，12000r/in離心15in，汲取上清參加異丙醇0.05L，室溫放置10in后12000r/in離心10in，沉淀參加750L/L乙醇清洗混勻后，7500r/in離心5in，沉淀37烘干后溶于DEP水20L中，用A260/A280比值鑒定R

8、NA純度。在Invitrgen公司的TherSriptTRT逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以lig(dT)20為引物，50反響1h，85反響30in，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。取逆轉(zhuǎn)錄反響液2L進(jìn)展PR擴(kuò)增，BDNFDNA特異性引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)5，上游引物為5-ATTGATGGGAG-3，下游引物為5-GATTTAGGTGAATATAG-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度為430bp。反響條件：94變性1in，60退火1in，72延伸1in，30個(gè)循環(huán)。取10L擴(kuò)增產(chǎn)物行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶的光密度由凝膠成像儀分析。1.2.5esternBltting檢測(cè)培養(yǎng)液上清中BDNF蛋白的表達(dá)以I分別為0，50，100

9、，200，400的病毒量感染S，感染后24h搜集培養(yǎng)液上清。上清經(jīng)低速離心去除分子質(zhì)量小于3000u的蛋白，150g/LSDS電泳后，蛋白經(jīng)100V恒壓，1h電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，TBST洗膜后用30g/LBSA/PBS室溫封閉2h，兔抗BDNF多克隆抗體11004孵育過(guò)夜，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG1100室溫孵育3h，TBST洗膜后EL化學(xué)發(fā)光法顯影，條帶的光密度由凝膠成像儀分析。1.2.6ELISA檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)的時(shí)效性感染組以I為200的病毒量感染的S，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的同一代S，分別在感染后3，6，9，12，15，18，21d搜集培養(yǎng)液上清。搜集到的上清保存于-

10、80。檢測(cè)步驟按照Prega公司的BDNF蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)展。全部數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展方差分析。2結(jié)果2.1Ad-BDNF的滴度測(cè)定Ad-BDNF的感染滴度經(jīng)蝕斑形成試驗(yàn)測(cè)定，病毒原液擴(kuò)增、純化后的感染滴度為8.161012pfu/L。2.2培養(yǎng)S形態(tài)鑒定在倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，SD大鼠源性原代S接種24h后多數(shù)細(xì)胞已貼壁、伸展；72h后生長(zhǎng)良好，形成較多單克隆集落。原代S經(jīng)810d傳代1次。S的典型形態(tài)為長(zhǎng)梭狀，胞體細(xì)長(zhǎng)，胞核不明顯，胞膜折光性強(qiáng)；細(xì)胞間呈復(fù)層生長(zhǎng)，胞體互相重疊，單克隆集落常呈索帶狀。S-100染色陽(yáng)性細(xì)胞為S，其胞體內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色以胞質(zhì)為主

11、,強(qiáng)陽(yáng)性時(shí)胞核也會(huì)出現(xiàn)著色，細(xì)胞邊界清楚，與鏡下所見(jiàn)形態(tài)一致。2.3感染后S中BDNFRNA的表達(dá)提取感染各組和對(duì)照組S的總RNA，用RT-PR均擴(kuò)增出了約430bp的基因片段，與構(gòu)建的表達(dá)單元大小一致，其中DNA條帶灰度以I為200組為著，對(duì)照組最低。此結(jié)果證實(shí)，經(jīng)Ad-BDNF感染的S有BDNFRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于未感染的S；I為200感染時(shí)，人源性BDNF基因轉(zhuǎn)染效率最高圖1。0:未感染對(duì)照組，1:I50，2:I100，3:I200，4:I400，:DNAarker圖1不同I感染S后BDNFRNA的表達(dá)2.4感染后S無(wú)血清培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)由于構(gòu)建的BDNF基因帶有

12、BHGpA信號(hào)肽序列，因此S表達(dá)的蛋白可以分泌至培養(yǎng)液上清中。經(jīng)esternBltting檢測(cè)，Ad-BDNF感染各組和對(duì)照組的S培養(yǎng)液上清均有13ku的BDNF蛋白條帶存在，其中蛋白條帶灰度以I為200組為著，對(duì)照組最低。此結(jié)果證實(shí)，經(jīng)Ad-BDNF感染的S的BDNF表達(dá)量明顯高于正常培養(yǎng)的S；I為200感染時(shí)表達(dá)效率最高，這與RT-PR檢測(cè)的RNA結(jié)果比擬吻合圖2。0:未感染對(duì)照組，1:I50，2:I100，3:I200，4:I400圖2不同I感染S后培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)2.5ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)感染的S在感染3d后BDNF表達(dá)量即開(kāi)場(chǎng)出現(xiàn)升高，612d升高趨勢(shì)明

13、顯，1521d升高趨勢(shì)減緩，但BDNF表達(dá)量可以維持在較高程度，即15,18,21d時(shí)BDNF表達(dá)量無(wú)顯著性差異(多樣本均數(shù)間SNK-q檢驗(yàn)，P0.01)。對(duì)照組也表現(xiàn)出隨著時(shí)間變化，BDNF表達(dá)量升高趨勢(shì)，但在各時(shí)間點(diǎn)BDNF表達(dá)量均明顯低于感染組(配對(duì)t檢驗(yàn)，P0.01，表1)。3討論在研究視神經(jīng)損傷的早期，學(xué)者們普遍認(rèn)為視神經(jīng)作為特殊分化的中樞神經(jīng)在損傷后不可修復(fù)和再生，這一觀點(diǎn)直到1981年才被Aguay等6推翻，他們發(fā)現(xiàn)受損的RG軸突在含有S的周圍神經(jīng)橋接物中可以再生。其中S不僅在視神經(jīng)損傷處形成細(xì)胞索支持和引導(dǎo)再生的神經(jīng)軸突長(zhǎng)入和延伸，還能分泌包括BDNF在內(nèi)的多種NTF營(yíng)養(yǎng)受損的

14、RG7。之后的研究又證實(shí)BDNF對(duì)于視神經(jīng)損傷修復(fù)是較為肯定的。Saai等8采用眼球內(nèi)注射BDNF可以促進(jìn)軸突切斷后RG的存活及軸突的再生。Hisanari等9將負(fù)載有細(xì)胞外基質(zhì)extraellularatrix,E、體外培養(yǎng)的S和BDNF的硅膠導(dǎo)管橋接大鼠視神經(jīng)斷端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)RG軸突再生的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于負(fù)載任一單因素的硅膠導(dǎo)管。侯旭等10,11采用向視神經(jīng)夾傷后的大鼠玻璃體腔內(nèi)注射Ad-BDNF的方法發(fā)現(xiàn)，其可以轉(zhuǎn)染外源性BDNF基因到RG中并促進(jìn)RG的存活及軸突的再生。但這些方法在臨床應(yīng)用上仍缺乏可行性和平安性，作用比擬有限。我們借助組織工程學(xué)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將培養(yǎng)的S和外源性BDNF

15、基因結(jié)合起來(lái)，試圖將其進(jìn)一步應(yīng)用于視神經(jīng)損傷修復(fù)。在轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率的平衡點(diǎn)上我們選擇了腺病毒載體，它不僅可以感染包括神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞12，而且具有轉(zhuǎn)染效率高，耐受性好，低病源性等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果證實(shí)，Ad-BDNF可以有效感染體外培養(yǎng)的SD大鼠源性S，并介導(dǎo)外源性BDNF基因轉(zhuǎn)染到S中，而轉(zhuǎn)染有BDNF基因的S可以高效表達(dá)BDNF蛋白。通過(guò)以不同I感染S，我們發(fā)現(xiàn)制備后感染滴度為8.161012pfu/L的Ad-BDNF在I為200時(shí)轉(zhuǎn)染BDNF基因效率最高。這可能與制備的Ad-BDNF本身性質(zhì)有關(guān)。在討論感染的S分泌BDNF的時(shí)效性時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)隨著感染后時(shí)間的延長(zhǎng)，分泌的BD

16、NF在短期內(nèi)感染后3d即呈現(xiàn)出明顯的升高趨勢(shì)，說(shuō)明腺病毒載體轉(zhuǎn)染的高效性。在10d內(nèi)感染后312d很快到達(dá)較高濃度后進(jìn)入維持階段，維持10d感染后1221d甚至更長(zhǎng)時(shí)間。這種長(zhǎng)效性為將其應(yīng)用于視神經(jīng)損傷修復(fù)，防止屢次反復(fù)給藥提供了先決條件。與未感染對(duì)照組比擬，感染組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組P0.01，分別在感染后12，15，18，21d升高了5.2，5.0，4.7，4.4倍。在維持階段，感染組的BDNF表達(dá)量略有下降，可能與S生長(zhǎng)密度過(guò)高、發(fā)生接觸抑制和少數(shù)外源性BDNF基因的衰減、喪失等因素有關(guān)?？傊ㄟ^(guò)腺病毒介導(dǎo)外源性BDNF基因的轉(zhuǎn)染，可以獲得高效、長(zhǎng)效表達(dá)BDNF蛋白的S

17、，這將為進(jìn)一步修復(fù)視神經(jīng)損傷和恢復(fù)一定程度的視功能提供前提條件。在含有高濃度BDNF的微環(huán)境下，受損的RG可能更容易存活、軸突更容易再生。轉(zhuǎn)染有BDNF基因的S能否通過(guò)細(xì)胞支架材料復(fù)合移植的方法應(yīng)用于視神經(jīng)損傷后RG的修復(fù)和再生？這些問(wèn)題還有待下一步實(shí)驗(yàn)解決?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Takan,HrieH,IijiaY,Dezaa,SaadaH,IshikaaY.Brain-derivedneurtrphifatrenhanesneuriteregeneratinfrretinalganglinellsinagedhuanretinainvitr.ExpEyeRes,2002;74(2):319-323

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